東亞飛蝗Lm-ATP5A功能分析及其在提高綠僵菌毒力中的作用研究.pdf

1、東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis)是我國(guó)重要的遷飛性害蟲(chóng)。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)其防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥。然而，長(zhǎng)時(shí)間、單一、過(guò)分依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥，已導(dǎo)致“3R”問(wèn)題。綠僵菌已被開(kāi)發(fā)成多種制劑應(yīng)用于農(nóng)林害蟲(chóng)的防治，但其致死時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重制約其推廣應(yīng)用。篩選新的殺蟲(chóng)靶標(biāo)，研制安全、高效的殺蟲(chóng)劑是提高殺蟲(chóng)劑質(zhì)量的核心路徑。ATP合成酶是生物體的能量工廠(chǎng)，它利用質(zhì)子梯度生成ATP，從而提供細(xì)胞和生物體所需90％的能量?；谠?/p>

2、酶對(duì)生物體的重要性，有可能成為潛在的殺蟲(chóng)靶標(biāo)。本研究的目標(biāo)，一是以RNA干擾為技術(shù)手段，篩選新的安全、高效的殺蟲(chóng)靶標(biāo)；二是嘗試?yán)美ハx(chóng)病原真菌表達(dá)害蟲(chóng)靶標(biāo)雙鏈RNA，通過(guò)干擾寄主昆蟲(chóng)必需基因的方式提供真菌的殺蟲(chóng)毒力，探索提高真菌殺蟲(chóng)毒力的新方法。
　　東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基的基因克隆及其功能研究通過(guò)序列比對(duì)及3`-RACE，從東亞飛蝗中克隆到東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基(Lm-ATP5A)的cDNA序列。序列全長(zhǎng)18

3、88bp，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1656bp，編碼551個(gè)氨基酸。設(shè)計(jì)了Lm-ATP5A的210bp特異片段，體外合成dsRNA，每頭蟲(chóng)注射100ng dsATP5A，成功降低了靶標(biāo)基因的表達(dá)，降低了酶活，使胞內(nèi)ATP含量降低；注射dsRNA還降低了血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量，使血細(xì)胞中線(xiàn)粒體數(shù)量減少以及改變線(xiàn)粒體形態(tài)及膜電勢(shì)；東亞飛蝗若蟲(chóng)和成蟲(chóng)在注射dsRNA后都會(huì)死亡，注射dsRNA對(duì)五齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)的LT50分別為2.3天、4.2天。上述結(jié)果表明：

4、Lm-ATP5A是東亞飛蝗的必需基因，是防治東亞飛蝗的潛在靶標(biāo)。
　　表達(dá)dsATP5A綠僵菌工程菌株的構(gòu)建及其毒力測(cè)定以蝗綠僵菌CQMa102為受體菌，運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將ATP5A-RNAi干擾載體導(dǎo)入受體菌，篩選獲得表達(dá)dsATP5A的轉(zhuǎn)化菌株。半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，dsATP5A在轉(zhuǎn)基因菌株中獲得成功轉(zhuǎn)錄。將野生菌株、工程菌株的孢子分別點(diǎn)滴侵染東亞飛蝗五齡若蟲(chóng)，工程菌株的LT50比野生型減少10.9%

5、（p<0.05）；定量PCR和Western blot分析了東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因表達(dá)，結(jié)果顯示：與野生型蝗綠僵菌相比，工程菌株侵染后東亞飛蝗體內(nèi)Lm-ATP5A轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)量均明顯降低；工程菌株侵染5天后，昆蟲(chóng)血腔中蟲(chóng)菌體含量為野生型的15.8倍。以上結(jié)果表明:利用昆蟲(chóng)病原真菌“蝗綠僵菌”能夠表達(dá)東亞飛蝗的dsATP5A，表達(dá)dsATP5A的工程菌株能夠干擾東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且能夠加速在昆蟲(chóng)血