金龜子綠僵菌致病相關(guān)基因Mmnt1和Mpt的克隆及功能分析.pdf

1、綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲的生物防治中起著重要作用。綠僵菌侵染寄主的過程是個(gè)動(dòng)態(tài)復(fù)雜的過程，但是目前僅初步闡明了金龜子綠僵菌通過分泌蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等水解酶穿透寄主表皮，以及真菌侵入昆蟲血腔后分泌酸性磷酸酶和海藻糖酶消耗宿主營(yíng)養(yǎng)的機(jī)理。
　　 病原真菌致病的關(guān)鍵時(shí)期即侵入昆蟲血腔后到寄主死亡前的時(shí)期（侵入后），這一階段的研究還不是很清楚,但是這一階段對(duì)真菌致病又是相

2、當(dāng)重要的。因此，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了金龜子綠僵菌在蝗蟲體內(nèi)特異表達(dá)基因的差減文庫，在此基礎(chǔ)上，我們選擇了蝗蟲體內(nèi)高表達(dá)的EST 序列，編號(hào)分別為GO004730和GO004735，長(zhǎng)度分別為565 bp和456 bp。這兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)分別同其他真菌中的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和α-1,2 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶有很高的同源性，利用SMART技術(shù)分別獲取cDNA全長(zhǎng)；利用定量PCR分析Mpt基因的表達(dá)譜，同時(shí)利用RNAi的方法研究了Mmnt1的功能。主要研

3、究結(jié)果如下：
　　 ①獲取了Mmnt1和Mpt基因的cDNA 全長(zhǎng)，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。
　　 Mmnt1基因cDNA 全長(zhǎng)1557bp，包括一個(gè)1296bp的開放閱讀框，125bp的5'UTR，136bp的3'UTR。cDNA 序列的Genbank 登錄號(hào)為GU990223。預(yù)測(cè)該基因編碼431個(gè)氨基酸。推測(cè)含有信號(hào)肽，其序列為MVAGNARYVRYIIIAVFTLAVFYFVSNSKY，其切割位點(diǎn)位于AVFVSN

4、S-KY 之間。Mpt基因cDNA 全長(zhǎng)1194 bp，開放閱讀框?yàn)?026 bp，63 bp的5'UTR，105 bp的3'UTR。cDNA 序列的Genbank 登錄號(hào)為GU271134。預(yù)測(cè)該基因編碼341個(gè)氨基酸。推測(cè)信號(hào)肽序列為MAWFTGRFMAGEVAAILSAFALGYL，切割位點(diǎn)位于SAFALG-YL 之間②利用獲取的全長(zhǎng)cDNA與綠僵菌基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析獲得Mmnt1和Mpt基因的DNA全長(zhǎng)。
　　 將DN

5、A 序列與cDNA序列用bl2seq軟件比對(duì)，結(jié)果表明：Mmnt1基因的DNA全長(zhǎng)1711 bp，含有兩個(gè)內(nèi)含子（177bp-291bp）,(1469bp-1525bp)。Mpt基因的DNA全長(zhǎng)1380bp，含有一個(gè)內(nèi)含子（862bp-937bp）。分析內(nèi)含子都具有典型的GT….AG邊界。
　　 ③定量PCR 分析Mpt基因在不同侵染時(shí)期的表達(dá)情況。
　　 定量PCR 檢測(cè)Mpt基因在不同侵染階段的表達(dá)量，結(jié)果表明該基因

6、在附著孢階段、侵染初期以及在1/4SDA培養(yǎng)基的條件下，表達(dá)量都很低，相對(duì)表達(dá)量分別為17.68％，17.70％和4.85％，而侵染后期及蟲體產(chǎn)孢時(shí)期與之相比，表達(dá)量明顯增加，相對(duì)表達(dá)量為81.23％和100％。
　　 ④利用RNAi的方法對(duì)Mmnt1基因的功能進(jìn)行研究。干擾片段連接至RNA干擾載體（pbar-RNAi-gpd-trp）后，基因槍法轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌CQMa102，經(jīng)過PCR 篩選,獲得5個(gè)Mmnt1基因的干擾突變

7、株，并用定量PCR的方法檢測(cè)干擾突變株中Mmnt1基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，干擾突變株在不同侵染時(shí)期的干擾效率在40％-80％之間。
　　 ⑤對(duì)Mmnt1基因的干擾菌株進(jìn)行了生物量的測(cè)定。干擾菌株和野生菌株分別接種至1/4SDA液體培養(yǎng)基及添加各種細(xì)胞壁破壞素的情況下，生物量結(jié)果分析表明，干擾菌株在添加KCl和H2O2的培養(yǎng)基上菌絲干重明顯低于野生型，而在添加剛果紅，熒光增白劑以及沒有添加其他物質(zhì)的培養(yǎng)基上，干擾菌株菌絲干重與野生

8、型相比，差別不明顯。
　　 ⑥分析了Mmnt1基因干擾菌株在PDA培養(yǎng)基及添加各種細(xì)胞壁破壞素情況下的生長(zhǎng)形態(tài)。干擾菌株和野生菌株的孢懸液分別接種于固體PDA培養(yǎng)上，觀察其菌落形態(tài)的差別。觀察結(jié)果表明，與野生型相比，干擾菌株在添加KCl和H2O2的PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)明顯受到抑制，但在其他培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況和野生型相差不大。這一結(jié)果，也和生物量測(cè)結(jié)果定相一致。
　　 ⑦對(duì)Mmnt1基因的干擾突變株孢子進(jìn)行了了生物學(xué)毒力測(cè)