蝗綠僵菌MabrlA在產(chǎn)孢調(diào)控作用和致病機(jī)制中的功能研究.pdf

1、昆蟲(chóng)病原真菌在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治中作為重要的殺蟲(chóng)真菌，其分生孢子是殺蟲(chóng)真菌類農(nóng)藥的主要有效作用單元。因此，研究昆蟲(chóng)病原真菌產(chǎn)孢調(diào)控，對(duì)于提高孢子產(chǎn)率和孢子質(zhì)量，進(jìn)而促進(jìn)殺蟲(chóng)真菌農(nóng)藥應(yīng)用具有重要作用。brlA編碼一種C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在絲狀真菌產(chǎn)孢和菌絲生長(zhǎng)調(diào)控中起著中心調(diào)控作用，與abaA和wetA共同組成調(diào)控產(chǎn)孢特異基因表達(dá)的brlA-abaA-wetA中心途徑。在構(gòu)巢曲霉中，敲除該基因后產(chǎn)孢功能喪失，菌絲呈短而硬的毛發(fā)狀。但是，

2、在蝗綠僵菌中其功能沒(méi)闡明。本文實(shí)驗(yàn)材料采用昆蟲(chóng)病原真菌蝗綠僵菌，通過(guò)同源重組方法構(gòu)建基因敲除菌株和回復(fù)菌株對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用蝗綠僵菌全基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)和全基因組文庫(kù)，克隆得到 MabrlA全長(zhǎng)cDNA序列與構(gòu)建敲除載體所用的左右臂(800bp以上)序列；構(gòu)建MabrlA基因敲除載體和回復(fù)載體，進(jìn)行蝗綠僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化，篩選得到目標(biāo)轉(zhuǎn)化子；
　　2. MabrlA的缺失影響蝗綠僵菌的產(chǎn)孢、抗逆

3、特性和毒力。平板菌落和顯微觀察表明：敲除 MabrlA后，蝗綠僵菌產(chǎn)孢減少(菌落生長(zhǎng)減弱、產(chǎn)孢延遲、分枝數(shù)減少)；逆境敏感性測(cè)定結(jié)果表明：敲除MabrlA孢子耐受性降低。經(jīng)UV-B照射處理，ΔMabrlA菌株的半抑制萌發(fā)時(shí)間比WT和CP的半抑制萌發(fā)時(shí)間提前2.8h；熱激處理后，ΔMabrlA菌株的半抑制萌發(fā)時(shí)間比 WT和 CP的半抑制萌發(fā)時(shí)間提前1.7h。在添加細(xì)胞壁破壞劑的培養(yǎng)基上,ΔMabrlA菌株耐受性降低。ΔMabrlA菌株細(xì)胞

4、壁厚度極顯著增厚。
　　3.在蝗綠僵菌中，利用定量PCR技術(shù)，分別測(cè)定MaflbA、MaflbC、Maste12、MabrlA、MafluG、MafadA和MawetA敲除突變菌株中其它產(chǎn)孢調(diào)控基因的表達(dá)水平，確定兩條調(diào)控途徑：由 fluG-flbs產(chǎn)孢調(diào)控途徑和 FadA(Gα）產(chǎn)孢調(diào)控途徑共同調(diào)控產(chǎn)孢，brlA處于調(diào)控途徑的關(guān)鍵位置，flbB和flbC雙向調(diào)控產(chǎn)孢；
　　4.蝗綠僵菌MabrlA調(diào)控孢子細(xì)胞壁主要成分的含

5、量和分布，從而影響其抗逆特性。熒光染料染色總甘露聚糖，發(fā)現(xiàn)ΔMabrlA菌株孢子表面暴露出來(lái)的總甘露糖的熒光強(qiáng)度弱于WT，ΔMabrlA菌株孢子表面暴露出來(lái)的殼聚糖的熒光強(qiáng)度弱于WT，ΔMabrlA菌株的β-1,3-葡聚糖熒光強(qiáng)度與WT無(wú)差異；ΔMabrlA菌株菌絲表面暴露出來(lái)的殼聚糖分布不均勻。提取細(xì)胞壁組成分析，ΔMabrlA菌株的幾丁質(zhì)含量是野生型的三倍，甘露糖蛋白是野生型菌株的30％，而葡聚糖含量與野生型相差不大。
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6、.蝗綠僵菌MabrlA缺失導(dǎo)致東亞飛蝗體液免疫、細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，是其毒力喪失的重要機(jī)制。經(jīng)ΔMabrlA菌株處理的蝗蟲(chóng)不死亡，ΔMabrlA菌株的附著胞形成率顯著少于WT、附著胞的膨壓降低。附著胞穿透體表過(guò)程中，ΔMabrlA菌株的水解蛋白酶 Pr1和 Chi上調(diào)表達(dá)；ΔMabrlA菌株在蝗蟲(chóng)體內(nèi)不生長(zhǎng)；ΔMabrlA菌株的黑化作用加強(qiáng)、酚氧化酶活性提高；血細(xì)胞和脂肪體中 TOLL通路免疫信號(hào)基因 Lmspatzle、Lmcactus