蝗綠僵菌葡聚糖苷轉移酶基因的功能研究.pdf

1、昆蟲容易受病原真菌感染而致病，其攜帶的病原真菌會進一步傳播和擴散造成大面積的昆蟲群感染并死亡。因此，利用昆蟲病原真菌防治農業(yè)害蟲是一種長效和環(huán)保的生防措施。真菌細胞壁是真菌細胞外周的重要結構，為真菌抵御外界不良環(huán)境和寄主免疫反應等提供保護，葡聚糖苷轉移酶具有水解和轉移酶的活性，在葡聚糖分子組裝和維持細胞壁完整性方面具有重要作用。但是其在真菌生長發(fā)育過程中的作用機制還不清楚。闡明葡聚糖苷轉移酶在病原真菌中的功能將為提高真菌農藥的毒力及的篩

2、選提供參考依據(jù)。為此，本課題以蝗綠僵菌為試驗材料，采用同源重組技術構建了葡聚糖苷轉移酶敲除及回復菌株，對其生長、毒力及抗逆特性進行了初步的分析。
　　主要研究內容：
　　1.采用生物信息學分析基因的結構
　　2.構建敲除及回復菌株
　　利用同源重組方法構建了ΔMwg2，ΔMwg3，Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3敲除及回復菌株。
　　3.基因的功能分析
　　(1)生長特性分析：對野生、敲除及回復

3、菌株的孢子進行接種培養(yǎng)，測定其萌發(fā)率和產孢量并觀察其菌絲的結構。
　　(2)抗逆特性分析：對野生、敲除和回復菌株的孢子分別進行熱激、紫外照射處理，統(tǒng)計萌發(fā)率，比較其萌發(fā)半抑制時間的差異。
　　(3)毒力分析：用新鮮成熟的野生、敲除型菌株的孢子配制成孢懸液，采用體內注射和體表侵染方法感染東亞飛蝗，統(tǒng)計半致死時間，分析毒力差異。
　　主要研究結果：
　　1.經(jīng)過生物信息學分析得出，Mwg1：GenBank：EFY91

4、318.1，cDNA是1367bp，氨基酸大小是406aa，等電點是5.22pI，分子量是41kDa，其中含有1個內含子；Mwg2：GenBank：EFY92943.1，cDNA是998bp，氨基酸大小是277aa，等電點是5.03pI，分子量是26kDa，其中含有1個內含子；Mwg3：GenBank：EFY86494.1，cDNA是1669bp，氨基酸大小是511aa，等電點是4.89pI，分子量是52kDa，其中含有2個內含子。

5、r>　　2.本實驗構建了Mwg2、Mwg3和 CP1、CP2、CP3菌株，同時構建了Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3菌株
　　3.葡聚糖苷轉移酶基因對蝗綠僵菌生長特性的影響
　　(1)萌發(fā)與產孢方面：Mwg1，Mwg3與WT和CP相比，產孢量增加，萌發(fā)提前;而Mwg2與 WT和 CP相比，產孢量減少，萌發(fā)延遲；Mwg1/Mwg2和Mwg2/Mwg3與WT相比，產孢量增加，萌發(fā)提前。
　　(2)菌絲結構方面：Mwg

6、1與WT和CP相比，菌絲末端更細長，菌絲膈間距離增大；Mwg2與WT和CP相比，分支數(shù)明顯增加；Mwg2與WT和CP相比，菌絲末端更細長，菌絲膈間距離增大；Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3與WT相比，菌絲末端更細長，菌絲膈間距離增大。
　　4.聚糖苷轉移酶基因對蝗綠僵菌抗逆特性的影響
　　(1)紫外耐受性方面：Mwg1、Mwg3、Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3與WT和CP相比，紫外處理后孢子萌發(fā)率提前，紫外耐受

7、力增強；Mwg2與WT和CP相比，紫外處理后孢子萌發(fā)率延遲，紫外耐受力減弱。
　　(2)濕熱耐受性方面：Mwg1與WT和CP相比，濕熱處理后孢子萌發(fā)率提前，濕熱耐受力增強；Mwg2與WT和CP相比，濕熱處理后孢子萌發(fā)率延遲，濕熱耐受力減弱；Mwg2、Mwg2/Mwg3與WT和CP相比無顯著性差異;Mwg1/Mwg2與WT相比，濕熱處理后孢子萌發(fā)率提前。
　　(3)細胞壁敏感劑方面：在加有細胞壁敏感劑剛果紅的1/4SADAY平

8、板上，Mwg1與WT和CP相比，菌落形態(tài)明顯減小，生長緩慢；Mwg1/Mwg2與WT相比，也表現(xiàn)為生長緩慢，而其他敲除菌株無顯著性影響；各個菌株在添加有NaCl、Sor的1/4SADAY平板上生長情況與WT相比，無顯著性差異，說明葡聚糖苷轉移酶不影響綠僵菌對高滲透壓的耐受性。
　　5.聚糖苷轉移酶基因對蝗綠僵菌毒力的影響
　　主要采用了體表侵染和體內注射，分別制備敲除和WT菌株的孢懸液，感染東亞飛蝗，分析葡聚糖苷轉移酶基因對