蝗綠僵菌葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的功能研究.pdf

1、昆蟲(chóng)容易受病原真菌感染而致病，其攜帶的病原真菌會(huì)進(jìn)一步傳播和擴(kuò)散造成大面積的昆蟲(chóng)群感染并死亡。因此，利用昆蟲(chóng)病原真菌防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)是一種長(zhǎng)效和環(huán)保的生防措施。真菌細(xì)胞壁是真菌細(xì)胞外周的重要結(jié)構(gòu)，為真菌抵御外界不良環(huán)境和寄主免疫反應(yīng)等提供保護(hù)，葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶具有水解和轉(zhuǎn)移酶的活性，在葡聚糖分子組裝和維持細(xì)胞壁完整性方面具有重要作用。但是其在真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制還不清楚。闡明葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶在病原真菌中的功能將為提高真菌農(nóng)藥的毒力及的篩

2、選提供參考依據(jù)。為此，本課題以蝗綠僵菌為試驗(yàn)材料，采用同源重組技術(shù)構(gòu)建了葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶敲除及回復(fù)菌株，對(duì)其生長(zhǎng)、毒力及抗逆特性進(jìn)行了初步的分析。
　　主要研究?jī)?nèi)容：
　　1.采用生物信息學(xué)分析基因的結(jié)構(gòu)
　　2.構(gòu)建敲除及回復(fù)菌株
　　利用同源重組方法構(gòu)建了ΔMwg2，ΔMwg3，Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3敲除及回復(fù)菌株。
　　3.基因的功能分析
　　(1)生長(zhǎng)特性分析：對(duì)野生、敲除及回復(fù)

3、菌株的孢子進(jìn)行接種培養(yǎng)，測(cè)定其萌發(fā)率和產(chǎn)孢量并觀察其菌絲的結(jié)構(gòu)。
　　(2)抗逆特性分析：對(duì)野生、敲除和回復(fù)菌株的孢子分別進(jìn)行熱激、紫外照射處理，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，比較其萌發(fā)半抑制時(shí)間的差異。
　　(3)毒力分析：用新鮮成熟的野生、敲除型菌株的孢子配制成孢懸液，采用體內(nèi)注射和體表侵染方法感染東亞飛蝗，統(tǒng)計(jì)半致死時(shí)間，分析毒力差異。
　　主要研究結(jié)果：
　　1.經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析得出，Mwg1：GenBank：EFY91

4、318.1，cDNA是1367bp，氨基酸大小是406aa，等電點(diǎn)是5.22pI，分子量是41kDa，其中含有1個(gè)內(nèi)含子；Mwg2：GenBank：EFY92943.1，cDNA是998bp，氨基酸大小是277aa，等電點(diǎn)是5.03pI，分子量是26kDa，其中含有1個(gè)內(nèi)含子；Mwg3：GenBank：EFY86494.1，cDNA是1669bp，氨基酸大小是511aa，等電點(diǎn)是4.89pI，分子量是52kDa，其中含有2個(gè)內(nèi)含子。

5、r>　　2.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Mwg2、Mwg3和 CP1、CP2、CP3菌株，同時(shí)構(gòu)建了Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3菌株
　　3.葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶基因?qū)染G僵菌生長(zhǎng)特性的影響
　　(1)萌發(fā)與產(chǎn)孢方面：Mwg1，Mwg3與WT和CP相比，產(chǎn)孢量增加，萌發(fā)提前;而Mwg2與 WT和 CP相比，產(chǎn)孢量減少，萌發(fā)延遲；Mwg1/Mwg2和Mwg2/Mwg3與WT相比，產(chǎn)孢量增加，萌發(fā)提前。
　　(2)菌絲結(jié)構(gòu)方面：Mwg

6、1與WT和CP相比，菌絲末端更細(xì)長(zhǎng)，菌絲膈間距離增大；Mwg2與WT和CP相比，分支數(shù)明顯增加；Mwg2與WT和CP相比，菌絲末端更細(xì)長(zhǎng)，菌絲膈間距離增大；Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3與WT相比，菌絲末端更細(xì)長(zhǎng)，菌絲膈間距離增大。
　　4.聚糖苷轉(zhuǎn)移酶基因?qū)染G僵菌抗逆特性的影響
　　(1)紫外耐受性方面：Mwg1、Mwg3、Mwg1/Mwg2、Mwg2/Mwg3與WT和CP相比，紫外處理后孢子萌發(fā)率提前，紫外耐受

7、力增強(qiáng)；Mwg2與WT和CP相比，紫外處理后孢子萌發(fā)率延遲，紫外耐受力減弱。
　　(2)濕熱耐受性方面：Mwg1與WT和CP相比，濕熱處理后孢子萌發(fā)率提前，濕熱耐受力增強(qiáng)；Mwg2與WT和CP相比，濕熱處理后孢子萌發(fā)率延遲，濕熱耐受力減弱；Mwg2、Mwg2/Mwg3與WT和CP相比無(wú)顯著性差異;Mwg1/Mwg2與WT相比，濕熱處理后孢子萌發(fā)率提前。
　　(3)細(xì)胞壁敏感劑方面：在加有細(xì)胞壁敏感劑剛果紅的1/4SADAY平

8、板上，Mwg1與WT和CP相比，菌落形態(tài)明顯減小，生長(zhǎng)緩慢；Mwg1/Mwg2與WT相比，也表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，而其他敲除菌株無(wú)顯著性影響；各個(gè)菌株在添加有NaCl、Sor的1/4SADAY平板上生長(zhǎng)情況與WT相比，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶不影響綠僵菌對(duì)高滲透壓的耐受性。
　　5.聚糖苷轉(zhuǎn)移酶基因?qū)染G僵菌毒力的影響
　　主要采用了體表侵染和體內(nèi)注射，分別制備敲除和WT菌株的孢懸液，感染東亞飛蝗，分析葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶基因?qū)?/p>