綠僵菌葡聚糖轉(zhuǎn)移酶Mwg1的基因功能研究.pdf

1、真菌細(xì)胞壁是真菌的重要器官，在保護(hù)真菌、抵抗外界不良環(huán)境以及真菌生長(zhǎng)、發(fā)育等過程中起著不可替代的作用。真菌細(xì)胞壁主要由多糖（葡聚糖，幾丁質(zhì)，甘露聚糖)和糖蛋白組成。目前的研究對(duì)真菌細(xì)胞壁合成相關(guān)的酶報(bào)道較多，而對(duì)細(xì)胞在生長(zhǎng)期間進(jìn)行重建和的擴(kuò)展所需要的水解酶類報(bào)道較少。葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶具有水解和轉(zhuǎn)移酶的活性，在酵母中有延長(zhǎng)1,3-β-葡聚糖鏈或以1,6-β-糖苷鍵與1,3-β-葡聚糖鏈連接形成分支鏈的作用。然而，葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能即

2、該基因在真菌生長(zhǎng)發(fā)育、侵染、抗逆等過程中的作用尚不十分清楚。為明確其功能，本項(xiàng)目以綠僵菌（Metarhiziumacridum，Ma）為試驗(yàn)材料，采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了葡聚糖苷轉(zhuǎn)移酶Mwg1的敲除菌株，并通過形態(tài)觀察、生物毒力測(cè)定、細(xì)胞壁多糖成分測(cè)定、抗逆性表型觀察等對(duì)其進(jìn)行了功能分析。
　　主要研究?jī)?nèi)容：
　　1.采用生物信息學(xué)方法分析Mwg1的基因結(jié)構(gòu)與功能。
　　從GenBank中搜索出Mwg1的基因組序列和氨基

3、酸序列；將Mwg1序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，分析該序列與其他基因的同源性。
　　2.構(gòu)建Mwg1的基因敲除菌株。
　　根據(jù)Mwg1的基因組序列設(shè)計(jì)引物，從綠僵菌Ma102基因組DNA中擴(kuò)增出Mwg1的左、右臂DNA片段，分別插入pMaDisrupter-3載體中Bar基因的5’端或3’端，構(gòu)建Mwg1的敲除載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)化子。通過PCR分析和Southernblotting驗(yàn)證獲得了Mwg1的缺失

4、菌株即?Mwg1。
　　3.Mwg1的基因功能分析。
　　（1）Mwg1在綠僵菌抗逆生長(zhǎng)中的作用：在加入CR、SDS、CFW等細(xì)胞壁干擾劑和加入KCl、山梨醇、甘露糖等滲透劑的PDA上培養(yǎng)?Mwg1，用WT做對(duì)照，觀察其菌落形態(tài)、菌絲在產(chǎn)孢量、生物量積累上的差異；將?Mwg1、WT的孢子涂布在PDA培養(yǎng)基上，用紫外照射1-5h，于28°C培養(yǎng)24小時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析其相對(duì)萌發(fā)率，比較兩者之間是否存在差異；將?Mwg1、WT的孢子用

5、45°C水浴恒溫箱孵育1-5h或65°C恒溫培養(yǎng)箱放置2-8h，涂布在PDA培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)24小時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析其相對(duì)萌發(fā)率，比較?Mwg1與WT之間是否存在差異；
　?。?）細(xì)胞壁多糖含量分析：將?Mwg1、WT的菌絲細(xì)胞壁酸處理后，分別用3,5-DNS比色法測(cè)定總糖含量、NaCl-H3BO3溶液紫外分光光度比色法測(cè)定甘露聚糖含量、SLP比色法測(cè)定β-1,3-葡聚糖含量，分析其細(xì)胞壁多糖的組成變化。
　?。?）?Mw

6、g1的毒力測(cè)定。分別將?Mwg1和WT孢子懸液，采用體內(nèi)注射和體表侵染兩種途徑感染東亞飛蝗，觀察測(cè)定體內(nèi)注射或體表侵染后蝗蟲死亡時(shí)間，通過統(tǒng)計(jì)半數(shù)致死時(shí)間，分析?Mwg1與WT對(duì)宿主蝗蟲的毒力差異。
　　主要研究結(jié)果：
　　1．生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示Mwg1的基因中有1個(gè)內(nèi)含子，Mwg1由406個(gè)氨基酸組成，其Mwg1蛋白分子量為41KD，等電點(diǎn)為5.22；Blast分析發(fā)現(xiàn)該基因與其它真菌的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)移酶基因有較高的同源性。

7、
　　2．成功構(gòu)建了Mwg1的敲除載體；PCR分析和Southernblotting驗(yàn)證獲得了兩個(gè)?Mwg1菌株。
　　3．Mwg1的基因功能分析。
　?。?）與WT相比，在含有剛果紅的PDA培養(yǎng)基上，?Mwg1明顯生長(zhǎng)緩慢，菌落直徑偏小，顯微觀察發(fā)現(xiàn)?Mwg1菌絲明顯減少；在PDA含KCl等滲透劑的培養(yǎng)基上，Mwg1與WT的生長(zhǎng)勻受到抑制，但兩者之間沒有顯著差異；熒光顯微鏡觀察Mwg1和WT的菌絲，發(fā)現(xiàn)Mwg1比WT

8、菌絲分支顯著減少、隔間長(zhǎng)度顯著增加；在加入SDS或CR的PDA培養(yǎng)基上，Mwg1比WT的產(chǎn)孢量顯著下降，但孢子萌發(fā)率差異不顯著；經(jīng)紫外照射2-4h，Mwg1孢子萌發(fā)率顯著高于WT；經(jīng)45°C水浴或65°C干熱處理后，Mwg1孢子萌發(fā)率與WT沒有顯著差異。
　　（2）菌絲細(xì)胞壁總糖，甘露聚糖，葡聚糖的含量測(cè)定結(jié)果顯示：?Mwg1與WT相比，總糖和β-1,3-葡聚糖的含量顯著降低，但甘露聚糖含量顯著增加。
　?。?）Mwg1與W