一種新的綠僵菌胞外蛋白磷酸酶的基因克隆、表達(dá)及特性研究.pdf

1、綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）是現(xiàn)在研究和應(yīng)用最多的蟲生真菌之一，其分泌的多種酶與侵染寄主有關(guān)。
　　 有研究報(bào)道綠僵菌（Metarhiziumspp.）分泌的一種新的胞外酪氨酸蛋白磷酸酶能夠在體外特異性地改變蝗蟲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白Toll受體和Trans-Golgip230蛋白磷酸化狀態(tài)，推測該磷酸酶可能影響寄主蝗蟲的體液免疫。本課題組在研究該新的胞外酪氨酸蛋白磷酸酶時(shí)發(fā)現(xiàn)了一段新的序列，該序列由綠僵菌胞外

2、酪氨酸蛋白磷酸酶mRNA前體（hnRNA）經(jīng)不同剪接方式產(chǎn)生，其與李振輪等學(xué)者研究綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶（GenBank登錄號No.DQ302474、No.EFY93239）同源，并且含有酪氨酸蛋白磷酸酶的標(biāo)志基序，推測該新的序列表達(dá)蛋白可能是一個(gè)新的酪氨酸蛋白磷酸酶。但是目前對于其結(jié)構(gòu)、生化特性與功能等尚不清楚。本試驗(yàn)以金龜子綠僵菌蝗變種(Metarhiziumanisopliaevar.acridum)CQMa102菌株為研究材料，

3、通過構(gòu)建巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）蛋白表達(dá)系統(tǒng)，對該新的序列進(jìn)行基因克隆、蛋白表達(dá)，并進(jìn)行酶特性分析，以期望從分子水平初步分析該蛋白，為后續(xù)研究人員從不同水平分析綠僵菌蛋白磷酸酶對蝗蟲體液免疫防御的影響提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 為了獲得足夠量的活性良好的蛋白用于分析研究其生化特性，我們對該蛋白基因序列進(jìn)行克隆，構(gòu)建了攜帶目的基因ptp編碼序列的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-ptp，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71中，

4、得到重組子9k-PTPase。重組菌株在誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基(BMMY)中誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，SDS-PAGE和蛋白印跡結(jié)果顯示9k-PTPase成功表達(dá)了目標(biāo)蛋白，并初步確定蛋白表觀分子量近似為91kDa。對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后確定最佳誘導(dǎo)條件為以1％甲醇誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)畢赤酵母120h時(shí)表達(dá)外源蛋白相對酶活性最高。以該最佳發(fā)酵條件進(jìn)行外源蛋白大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，9k-PTPase表達(dá)上清濃縮后經(jīng)HisTrap親和柱純化得到的蛋白純度和均一性良好，

5、IEF-PAGE分析染色后確定其為磷酸酶，并且該磷酸酶pI近似為6.88。對磷酸酶進(jìn)行生化特性分析發(fā)現(xiàn):
　　 (1)該磷酸酶對5mMO-phospho-L-tryosine的最適作用溫度為50℃、最適作用pH為5.5。
　　 (2)磷酸酶底物特異性研究表明該磷酸酶對pTyr酶解活性顯著高于其他底物，表明該磷酸酶是蛋白磷酸酶。
　　 (3)磷酸酶抑制劑研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶抑制劑(NaF、EDTA)、酸

6、性磷酸酶抑制劑(EDTA)和堿性磷酸酶抑制劑(EDTA)對該磷酸酶酶解ρNPP沒有顯著抑制作用，表明磷酸酶不是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶;對堿性磷酸酶有強(qiáng)烈激活作用的金屬離子Ca2+、Mg2+在試驗(yàn)中對磷酸酶酶解ρNPP也沒有顯著激活作用，反而抑制酶降解ρNPP活性，表明該蛋白磷酸酶不是堿性磷酸酶;但是酪氨酸蛋白磷酸酶抑制劑（鉬酸鈉、鎢酸鈉）顯著抑制酶對ρNPP的活性，但是并沒有直接證據(jù)表明目標(biāo)蛋白是酪氨酸蛋白磷酸酶，又該酶對pThr、p