綠僵菌磷酸磷源誘導及其酵母表達和酶特性分析.pdf

1、蟲生病原真菌(EPF)對于自然地調(diào)節(jié)昆蟲、壁虱和螨蟲的數(shù)量，發(fā)揮著重要的作用。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)了超過750種昆蟲病原真菌。其中，綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一種最要的、研究最充分的蟲生病原菌之一。其廣泛的分布于世界各地的土壤之中，對大部分的昆蟲都具有生防能力。因為其有效的致病性，無毒害和無污染等優(yōu)點，使其成功的商品化應用于多個國家的生物防治領域。已有研究表明，胞外磷酸酶在綠僵菌侵染并致死害蟲寄主過程中發(fā)揮了重

2、要作用，因此加強對綠僵菌胞外磷酸酶的研究，將有助于為綠僵菌的侵染和致病機理的研究提供參考。
　　 一、不同磷源對金龜子綠僵菌CQMa102生物量及生成胞外磷酸酶的影響。
　　 本文利用搖瓶培養(yǎng)方法探究了無機磷(KH2PO4)、簡單有機磷（植酸鈉、磷酸苯二鈉）和蛋白有機磷（酪蛋白）為單獨磷源條件下，綠僵菌生物量、產(chǎn)胞外酸性磷酸酶以及酪氨酸蛋白磷酸酶、絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性的影響。實驗結(jié)果顯示:
　　 (1)酪蛋白

3、作為磷源的培養(yǎng)基，綠僵菌生物量高達4.94g/L;胞外蛋白的分泌量最大(395.0mg/L)，較其它磷源高出2-7倍;酸性磷酸酶的活性也是最高的(1208.5U/μg)，是其它磷源誘導下的2-10倍;但是酸性磷酸酶的比活和蛋白磷酸酶的活性卻顯著低于KH2PO4和磷酸苯二鈉為磷源下的酶活。
　　 (2)KH2PO4做磷源的培養(yǎng)基，綠僵菌的生物量(3.24g/L)與磷酸苯二鈉為磷源下的生物量(3.32g/L)沒有顯著的差異;其蛋白分

4、泌量和酸性磷酸酶活性都顯著高于磷酸苯二鈉下的值;但是酸性磷酸酶的比活和蛋白磷酸酶活性均低于磷酸苯二鈉誘導下的酶活。
　　 (3)植酸鈉為磷源的培養(yǎng)基中，綠僵菌生物量（0.59g/L）、酸性磷酸酶的活性和比活、以及酪氨酸蛋白磷酸酶的活性均是最低的;但是其蛋白的分泌量顯著高于磷酸苯二鈉中的量，并且絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶活顯著高于酪蛋白為磷源中的活性。
　　 (4)在磷酸苯二鈉為磷源的培養(yǎng)基中，由于胞外蛋白的分泌量最低(53

5、.95mg/L)，所以導致酸性磷酸酶的比活最高(5.99U/μg);同時其蛋白磷酸酶的活性和比活也是最高的。
　　 這表明，酪蛋白作為磷源，最有利于綠僵菌菌絲的生長、胞外蛋白和酸性磷酸酶的分泌;其次為加入KH2PO4和磷酸苯二鈉的培養(yǎng)基;加入植酸鈉的培養(yǎng)基不利于綠僵菌的生長代謝。然而，加入磷酸苯二鈉的培養(yǎng)基，最有利于酪氨酸蛋白磷酸酶、絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶的分離純化。
　　 二、綠僵菌胞外磷酸酶的畢赤酵母表達及其酶特性分析

6、。
　　 李振輪等已經(jīng)從綠僵菌胞外蛋白中純化出了一個新的酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPase)，并且成功克隆出了該PTPase基因全長序列，利用文庫篩選獲得了該基因的DNA序列(GenBankNo.DQ302474)，并且已經(jīng)證明了該PTPase在體外能特異的使蝗蟲Toll受體和Trans-Golgip230蛋白脫磷酸化。辛靜通過RT-PCR方法，已經(jīng)成功的對綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶進行基因克隆，并且構(gòu)建了PTPase基因的畢赤酵母表達

7、載體。
　　 本實驗通過使用不同遺傳霉素篩選方法對重組的畢赤酵母進行遺傳霉素的抗性篩選，然后進行PCR檢測，對正確克隆的菌株進行甲醇誘導培養(yǎng)，篩選出高效表達的菌株。將篩選出的高效表達菌株進行甲醇誘導培養(yǎng)，從粗酶液中通過超濾離心和Ni柱親和層析方法，分離純化出目的蛋白。對目的蛋白進行SDS-PAGE，IEF-PAGE以及Westernblot，并進行酶學特性分析。實驗結(jié)果顯示:
　　 (1)目的蛋白酪氨酸蛋白磷酸酶的分子量

8、為85kDa，等電點為6.15;最適pH為6.5，最適溫度為70℃。
　　 (2)抑制劑和金屬離子對PTPase酶活的影響:Ca2+(50mM)和Ba2+(1mM)幾乎不影響目的蛋白PTPase活性。抑制劑Dithiothreitol，β-mercaptoethanol，N-ethylmaleimide均表現(xiàn)出抑制作用;EDTA(20mM時，減少32.04％)，陰離子F(1mM時，減少34.44％)和金屬離子Ag+(1mM時，減

9、少37.21％)，Cu2+(5mM時，減少45.63％)，F(xiàn)e2+(10mM時，減少24.89％)，Zn2+(1mM時，減少30.52％)均顯著抑制了PTPase活性;而Sodiummolybdate(10mM時，增加54.92％)，Sodiumtungstate(20mM時，增加58.75％)，EDTA(10mM時，增加48.08％)，Ca2+(20mM時，增加68.62％)，F(xiàn)e2+(1mM時，增加37.87％)，Mg2+(20mM

10、時，增加65.16％)，Mn2+(20mM時，增加90.94％)，Ba2+(20mM時，增加45.02％)以及C02+(10mM時，增加110.41％)卻顯著的促進了PTPase活性。
　　 (3)酶底物特異性分析結(jié)果顯示:在最適溫度(70℃)和最適pH(6.5)下，O-phospho-L-tyrosine和ρNPP做底物，酪氨酸蛋白磷酸酶表現(xiàn)出了同樣高的活性;當?shù)孜餅镺-phospho-L-serine和O-phospho-L