布拉酵母預(yù)防腸炎沙門(mén)氏菌感染的機(jī)制研究及其堿性磷酸酶的重組表達(dá)與性質(zhì)分析.pdf

1、伍代朝布拉酵母預(yù)防腸炎沙門(mén)氏菌感染的機(jī)制研究及其堿性磷酸酶的重組表達(dá)與性質(zhì)分析l摘要布拉酵母在臨床上主要用于防治大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌、難辨梭菌、幽門(mén)螺桿菌、白假絲酵母和原蟲(chóng)等病原體感染引起的疾病。同時(shí)，布拉酵母分泌的堿性磷酸酶(AP)能夠?qū)Ω锾m氏陰性菌LPS去磷酸化，而阻斷由LPS介導(dǎo)的下游信號(hào)通路。本研究一方面研究布拉酵母預(yù)防腸炎沙門(mén)氏菌感染的機(jī)理。另一方面克隆布拉酵母堿性磷酸酶(SBAP)基因，并實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中重組

2、分泌表達(dá)，初步研究rAP對(duì)LPS去磷酸化作用，為該蛋白藥物治療LPS所致的疾病提供基礎(chǔ)。1)為了探討布拉酵母預(yù)防腸炎沙門(mén)氏菌感染的機(jī)理，構(gòu)建經(jīng)布拉酵母預(yù)處理的小鼠腸炎沙門(mén)氏菌感染模型。在感染后監(jiān)測(cè)小鼠體重變化及腸炎沙門(mén)氏菌在肝臟和盲腸中的數(shù)量，掃描電鏡觀察布拉酵母對(duì)腸道微生物的吸附作用，HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況。結(jié)果表明，感染后第1l天，布拉酵母緩解由腸炎沙門(mén)氏菌感染所致的小鼠體重下降的現(xiàn)象(259g：223g)(p005)。在盲

3、腸定植的腸炎沙門(mén)氏菌數(shù)由107cfu／g降低為105cfu／g，其在肝臟的數(shù)量由104cfu／g降低為4102cfu／g。肝組織HE染色結(jié)果表明，布拉酵母能夠緩解由腸炎沙門(mén)氏菌感染所引起的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)肝細(xì)胞所造成的肝損傷。2)本試驗(yàn)通過(guò)酵母屬AP蛋白序列相似性比對(duì)，據(jù)得到保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)兼并引物，克隆SBAP基因。構(gòu)建畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPICSAP，電轉(zhuǎn)畢赤酵母x33，將篩選后表達(dá)重組AP(rAP)的重組酵母在

4、200ml搖瓶水平放大誘導(dǎo)表達(dá)，其發(fā)酵液上清用HisTrapHP柱純化。結(jié)果表明，成功克隆SBAP基因，其大小為1701bp，無(wú)內(nèi)含子，包含一個(gè)終止密碼子，GenBank編號(hào)為KF471017。pPICSAP重組表達(dá)菌株在200ml搖瓶水平誘導(dǎo)表達(dá)120h時(shí)，rAP的濃度達(dá)到最大值為4366mg／l。純化過(guò)程中確定洗脫緩沖液中咪唑最適濃度為250mM，洗脫峰經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳和Bandscale軟件分析，呈單一條帶，其純度達(dá)到90

5、％以上。3)本試驗(yàn)初步測(cè)定在二乙醇胺緩沖液中，M92、EDTA、溫度和pH對(duì)rAP酶活性的影響，及在最佳酶活條件下測(cè)定rAP的比活。同時(shí)，在pH210的TrisHCl緩沖液中，體外檢測(cè)rAP對(duì)LPS去磷酸化功效，及腹腔注射經(jīng)rAP去磷酸化后的LPS對(duì)小鼠血清中TNFa表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，在二乙醇胺緩沖液中，rAP的最佳反應(yīng)條件是pH96，2mMM92，溫度為60℃，且EDTA為rAP的強(qiáng)抑制劑，1mM的EDTA將rAP的酶活抑制到

6、其活性的1837％。rAP比活為9912U／mg，是先前研究中重組表達(dá)的小牛腸AP比伍代朝布拉酵母預(yù)防腸炎沙門(mén)氏菌感染的機(jī)制研究及其堿性磷酸酶的重組表達(dá)與性質(zhì)分析3AbstractSaccharomycesboulardiiisusedinclinicalapplicationforprophylaxisandthetreatmentofavarietyofdiseasescausedbybacterialinfection，sucha

7、sEscheriacoli，Salmonellatyphimurium，Vibriocholera，Clostridiumdifficile，Helicobacterpylori，CandidaalbicansandprotozoaBesides，theAPof&boulardiiwithdetoxificationofLPSviadephosphorylatedthelipidAofLPSInthisresearchwepartlyr

8、evealedthepreventionmechanismof&boulardiiagainstSalmonellaenteritidisinfectionandheterologouslyexpressedthealkalinephosphataseof&boulardiiinPpastorisThedetailsoftheresearchareasfollows：1Torevealthemechanismofsboulardiiag

9、ainstsenteritidisinfection，weusedamousemodelofsenteritidisinfectionwhichpre—treatmentwithsboulardiiAfterSenteritidischallenged，weevaluatedtheamountsofSenteritidisincecumandintheliverBesides，cecumwerecollectedtoanalysethe

10、adsorptionbetween&boulardiiandintestinalmicrofloraHepatictissuesdamagewerealsoanalysedusingHEstainingTheresultsshowedthat&boulardiiremittedweightlossofmicecausedby&enteritidisinfection(259gto223g)p005)atthe1lthday，thecol

11、onisationofSenteritidisincecumcontentswasdecreasedfrom107cfWgto105cfu／gandthetranslocationbacteriainliverwasdecreasedfrom104cfu／gto4xl02cfu／gatthelOthday，andremittedthedamageofthelivercausedbytheinfiltrationofneutrophile

12、granulocyte，lymphocyteandplasmocyte，viadecreasingtheamountsofSenteritidisintheliver2Inthisresearch，inordertogettherecombinationalkalinephosphatase(rAP)WecloningoftheSBAPgene，andconstructionoftherecombinantplasmidspPICSAP

13、whichwerelinearizedbydigestionwithPmeIandtransformedintoPpastorisX33byelectroporationAfterscreeningfortransformants，thepositivetransformantswereselectedforenlargeexpressionin200mlshakefasksThefermentationsupernatantWaSus

14、edforpurificationofrAPbyHisTrapHPcolumnTheresultsshowedthatanovelSBAPgene(withoutintrons)wasclonedfromSboulardiiATCCMYA一796withaGenBankaccessionnumberKF471017Afterscreeningfortheenzymeactivityoftmnsformants，therAPwasexpr

15、essedinPpastor括X33withayieldof4366mg／1attheendof120hofinductioninashakerflaSkwith200mlfermentationbrothAfterpurificationbyaffinity—columnchromatographyoptimumconcentrationofimidazoleinelutionbufferwas250mM，thepeakfractio