人胎盤堿性磷酸酶變性與復(fù)性的研究.pdf

1、該文應(yīng)用分光光度法和熒光法研究了人胎盤堿性磷酸酶(Human PlacentalAlkaline Phosphatase,HPAP,E.C 3.1.3.1)在鹽酸胍變性和復(fù)性過程中構(gòu)象與活力的變化,旨在探討其折疊機(jī)制.結(jié)果表明:①在HPAP的鹽酸胍變性過程中,低濃度的鹽酸胍(<0.5mol/L)使變性平衡態(tài)酶的發(fā)射熒光強(qiáng)度略有下降,最大發(fā)射波長(zhǎng)不變,仍為340nm,酶活力增強(qiáng);隨鹽酸胍濃度的增加,其熒光強(qiáng)度不僅不再下降,反而升高,酶逐漸

2、失活;當(dāng)鹽酸胍濃度為1.5mol/L時(shí),其熒光光譜的最大峰位紅移,酶活力迅速下降;當(dāng)鹽酸胍濃度為3.0mol/L時(shí),最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)紅移至最大,為365nm,熒光強(qiáng)度增加,此時(shí)酶活力喪失;當(dāng)鹽酸胍濃度增至4.0mol/L時(shí),熒光強(qiáng)度仍繼續(xù)增加,直至5.0mol/L才停止變化.酶變性過程的雙相變化提示:酶變性過程中存在著三態(tài),即天然態(tài)、變性中間態(tài)及變性態(tài).②鹽酸胍變性酶應(yīng)用直接稀釋法及空氣氧化法復(fù)性,其最適復(fù)性條件如下:鹽酸胍變性濃度3.

3、0mol/L、鹽酸胍稀釋濃度0.5mol/L、復(fù)性溫度4℃、復(fù)性液pH9及復(fù)性時(shí)間24小時(shí).在此復(fù)性條件下,測(cè)得變性酶的復(fù)性率為27％,熒光發(fā)射波長(zhǎng)由365nm藍(lán)移至358nm.③在復(fù)性過程中加入巰基乙醇,變性中間態(tài)酶仍可完全復(fù)性;變性態(tài)酶的復(fù)性率得到了明顯的提高,復(fù)性率由27%增加到68.5%,熒光發(fā)射波長(zhǎng)由358nm進(jìn)而藍(lán)移至347.5nm.結(jié)果提示:HPAP在變性過程中存在三態(tài),即天然態(tài)、變性中間態(tài)及變性態(tài);變性中間態(tài)酶可完全復(fù)性