耐熱堿性磷酸酶分子突變體的結(jié)構(gòu)與功能變化.pdf

1、堿性磷酸酯酶(Alkaline Phosphatase，簡稱AP，EC3.1.3.1)是一種磷酸單酯酶，可作為工具酶以及同位素標記應用于分子生物學各項研究。近年來，一類能夠在極度高溫環(huán)境下生存的生物引起了國內(nèi)外科學家們的關(guān)注，研究者們發(fā)現(xiàn)，這些生物的酶具有特有的結(jié)構(gòu)和功能，即很高的耐熱性和70℃以上的最適反應溫度，有些酶在110℃甚至更高的溫度都有活性。高度的耐熱性以及較高的最適反應溫度使得這些酶類成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及蛋白質(zhì)

2、耐熱機制的極好的模型材料。 本實驗采用亞硝基胍和PCR誘變法獲得了200余個耐熱堿性磷酸酯酶基因的隨機突變體。我們對其中八個突變體進行了核苷酸序列的測定和突變體基因的原核表達、表達產(chǎn)物的分離純化、表達產(chǎn)物的酶活、最適反應溫度、熱穩(wěn)定性等指標的測定；并將所得到的TAP全序列提交到丹麥技術(shù)大學(Technical Universitv of Denmark)CBS中心的CPHmodels服務器(http：／／www.cbs.dt

3、u.dk／services／CPHmodels／)進行高級結(jié)構(gòu)預測，在獲得了與突變體具有最大相容性的已知結(jié)構(gòu)的大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的一個突變體(D153hd330n)A鏈的高級結(jié)構(gòu)之后，采用分子模擬的方法模擬出突變體酶蛋白前319肽的三級結(jié)構(gòu)，同時使用SWISS-PORT的Swiss-PDBviewer軟件對TAP突變體進行了二級結(jié)構(gòu)預測，分析了引起耐熱性變化的機理。取得的主要研究結(jié)果如下： 1)8個突變體的突變情況

4、：3號突變體核苷酸CCC→CUC<'1271> 氨基酸P→L<'424>5號突變體核苷酸CGG→CGA<'663> GUG→AUG<'1093> 氨基酸V→M<'365>25號突變體核苷酸CUC→CUU<'221> ACG→AUG<'323> 氨基酸T→M<'108>35號突變體核苷酸CCC→CUC<'1271> CUG→GGG<'1340> 氨基酸P→L<'424> L→G<'447>52號突變體核苷酸ACC→AUC<'419>氨基酸

5、T→I<'140>所有突變體核苷酸AGC→AAC<'299>，氨基酸N→S<'100>2)8個突變體的最適反應溫度：3、6、9、48號突變體的最適反應溫度有所下降，而5、35、52號基本不變；25號略有上升。但所有突變體的最適反應溫度都在70℃左右的小范圍內(nèi)變化。8個突變體的酶活力：幾乎所有突變體在70℃時都表現(xiàn)出了最大酶活力；同樣條件下誘導表達，25號和35號突變體的蛋白表達較其它突變體稍低。8個突變體酶的熱穩(wěn)定性：25號和35號熱穩(wěn)

6、定性有所上升； 5號、6號、9號、48號熱穩(wěn)定性有所 下降；而3號和52號熱穩(wěn)定性幾乎不變。3)突變體高級結(jié)構(gòu)模擬：Asn→Ser<'100>形成α螺旋的能力都比較弱，兩者的疏水性也相似，這一突變對蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象并無太大影響，僅僅是突變位點周圍氫鍵發(fā)生少量改變，因此可以認為這個突變對耐熱性和熱穩(wěn)定性的影響不大。親水的Thr<'108>突變成非極性的Met，導致與該位點空間相鄰的N<'116>親水氨基酸His的極性殘基——咪

7、唑環(huán)產(chǎn)生空間電位排斥，從而造成His所在的β折疊構(gòu)象發(fā)生改變。由于該構(gòu)象的改變在空間上距離酶的活性中心較接近，因此，該突變體酶的耐熱性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生較為明顯的變化。極性親水的Thr被另一個非極性疏水的Ile所取代，在高級結(jié)構(gòu)作用力上也僅僅是一個氫鍵發(fā)生改變，同時該位點也遠離酶的活性中心，因此，該突變對酶的活性、穩(wěn)定性和耐熱性的影響不大。 本研究得出的初步結(jié)論或推論如下： 1)經(jīng)過亞硝基胍和PCR誘變法獲得的一系列突變

8、體在核苷酸基礎(chǔ)上只發(fā)生了點突變，由此導致其蛋白質(zhì)的序列也只是發(fā)生了個別氨基酸的突變。氨基酸頻率分析顯示出蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)僅在個別位點上稍有變化，說明突變只是發(fā)生了轉(zhuǎn)換或顛換而不是插入突變或缺失突變。 2)根據(jù)TAP在發(fā)生突變之后，表現(xiàn)出的最適反應溫度、酶活性、以及熱穩(wěn)定性的變化可以推測，酶的耐熱性變化的程度和氨基酸替換發(fā)生的部位有關(guān)，非活性部位的替換通常只涉及最高耐受溫度的變化。遠離活性中心的個別位置的點突變對酶的高級結(jié)構(gòu)和酶

9、的耐熱性沒有顯著影響。個別或少數(shù)氨基酸的替換一般只能引起酶高級結(jié)構(gòu)的局部和細微的改變，之所以出現(xiàn)這種情況，是因為蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)是靠所有氨基酸殘基的各種弱鍵作用來維持的，每個氨基酸的貢獻都很有限，少數(shù)氨基酸變異所引起的弱鍵數(shù)量和能量的改變不足以對整個高級結(jié)構(gòu)的根基造成動搖，這與蛋白質(zhì)進化的總趨勢是相符的。 3)推測編碼序列(G+C)％的提高有助于耐熱性的提高。從密碼子偏好性分析，我們可以看出除了終止密碼子以外，使用相對頻率(R