棲熱菌屬菌株Thermus thermophilus XM中耐熱堿性磷酸酶的克隆、表達(dá)以及重組酶的性質(zhì)研究.pdf

1、海洋是人類最后一塊沒(méi)有開(kāi)發(fā)的疆域，海洋中的各種資源吸引著越來(lái)越多的科學(xué)工作者。海洋生物資源研究更是吸引著世界各國(guó)生物學(xué)家的注意。嗜熱的微生物是海洋生物中一個(gè)重要的成員，對(duì)它們的研究已經(jīng)成為國(guó)際熱點(diǎn)。有證據(jù)表明嗜熱菌是地球上形成的第一類生命形式，對(duì)他們的研究有重要的科學(xué)意義，同時(shí)對(duì)它們產(chǎn)生的各種酶的研究也具有各種工業(yè)和科學(xué)研究方面的意義。 本研究利用基因工程方法對(duì)分離到的棲熱菌屬的一菌株Thermus thermophilus

2、XM的堿性磷酸酶進(jìn)行了克隆、表達(dá)，對(duì)可溶的重組蛋白進(jìn)行了Ni柱純化。同時(shí)，對(duì)重組酶(rTAPase)的一些基本的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)表明Thermus thermophilus XM的AP基因的編碼序列由1506bp組成，編碼一個(gè)501個(gè)氨基酸殘基的多肽，其分子量為54.7KDa，N端有一個(gè)27個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。推測(cè)出的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)與同屬的其他菌株的AP具有高度保守性，與一些典型的中溫AP和其它屬的AP的對(duì)比表明，

3、在這些AP中，它們的活性位點(diǎn)和金屬結(jié)合位點(diǎn)具有高度保守性。該基因以N端加上一個(gè)6-His的形式在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。純化得到的可溶重組蛋白的濃度為154mg/ml。對(duì)rTAPase的性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明，該重組酶是一個(gè)高度耐堿的(最適反應(yīng)pH12.0)、中度耐熱的(最適反應(yīng)溫度在75-80℃范圍內(nèi))在AP。其在80℃保溫6小時(shí)后，活性仍然保留50％以上。作為一種金屬酶，一些二價(jià)金屬離子如Co2+，Mg2+，Mn2+和Fe2+等對(duì)rTAPa

4、se活性有促進(jìn)作用，而另外一些金屬離子如Cu2+，Ca2+，Zn2+和K+等對(duì)rTAPase活性有不同程度的抑制作用。兩種表面活性劑SDS和Triton X-100對(duì)rTAPase具有強(qiáng)烈的抑制作用。在最適反應(yīng)條件下，rTAPase催化水解對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽水解的Km值為0.034mM，著和其他的一些中溫和高溫的AP基本相同，表明rTAPase和其它來(lái)源的AP具有相近的催化能力。 嗜熱細(xì)菌是耐熱酶的主要來(lái)源，但是它們培養(yǎng)條件苛