犬弓首蛔蟲絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶1的表達(dá)、分布及功能研究.pdf

1、犬弓首蛔蟲（Toxocara canis）是弓首科、弓首屬的一種寄生線蟲，主要經(jīng)口、胎盤等途徑感染犬、狐等多種動(dòng)物。T.canis感染性幼蟲進(jìn)入終末宿主體內(nèi)后經(jīng)內(nèi)臟移行過(guò)程最終在腸道內(nèi)發(fā)育為成蟲，但當(dāng)進(jìn)入非特異性宿主體內(nèi)時(shí)，感染性幼蟲不能發(fā)育為成蟲，而是移行到宿主內(nèi)臟、肌肉、神經(jīng)系統(tǒng)等部位，成為滯育的感染性幼蟲。人及多種動(dòng)物意外攝食T.canis感染性蟲卵或未煮熟的肉/內(nèi)臟中的感染性幼蟲可感染該寄生蟲。多數(shù)人感染T.canis后無(wú)明顯的

2、癥狀，但會(huì)出現(xiàn)內(nèi)臟幼蟲移行癥（visceral larva migrans,VLM），眼睛幼蟲移行癥（ocularlarva migrans,OLM）以及隱性弓首蛔蟲病（covert toxocariasis/common toxocariasis,CT）。長(zhǎng)期慢性的T.canis感染還會(huì)侵害神經(jīng)系統(tǒng)，造成神經(jīng)弓首蛔蟲病（neurological toxocariasis,NT）。弓首蛔蟲感染可能會(huì)促進(jìn)呼吸系統(tǒng)疾?。ㄏ头卫w維化）、過(guò)

3、敏性疾?。责W和蕁麻疹）以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病（認(rèn)知障礙以及癲癇、精神分裂、癡呆、帕金森綜合征）的發(fā)生，引起了人們的極大關(guān)注。流行病學(xué)調(diào)查表明，弓首蛔蟲病呈世界性分布，以熱帶、亞熱帶地區(qū)流行情況最為嚴(yán)重。目前，弓首蛔蟲病的診斷仍存在敏感性低，特異性不高等缺點(diǎn)，藥物治療難以有效清除體內(nèi)移行的幼蟲，亟需新的診斷及防治策略來(lái)控制該病。
　　磷酸化/去磷酸化是蛋白質(zhì)功能轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的主要機(jī)制。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（serine/threo

4、nine phosphatases,STPs）是真核生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后水平去磷酸化作用的重要執(zhí)行者。根據(jù)氨基酸序列同源性、三維結(jié)構(gòu)以及對(duì)抑制劑的敏感性，STPs被劃分為磷酸蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatases,PPPs），鎂依賴性蛋白磷酸酶（protein phosphatases magnesium dependent,PPMs）和酪氨酸蛋白磷酸酶（protein tyrosine phosphatases,

5、PTPs）3個(gè)家族。STPs在寄生蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1（serine/threonine protein phosphatase1,PP1）是PPPs家族的重要成員，在真核生物中參與細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞骨架重組和信號(hào)傳導(dǎo)等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)節(jié)。在寄生蟲中，PP1還參與對(duì)宿主細(xì)胞的吸附、侵襲以及增殖或繁殖等活動(dòng)，是潛在的藥物靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)T.canisST

6、Ps的報(bào)道。
　　本研究克隆了Tc-stp-1全長(zhǎng)基因，對(duì)TcPP1的組織分布和TcPP1的亞細(xì)胞分布情況進(jìn)行了研究，利用RNA干擾技術(shù)對(duì)Tc-stp-1基因功能進(jìn)行了探討，試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下：
　　1.犬弓首蛔蟲Tc-stp-1基因的克隆及序列分析
　　采用5’RACE技術(shù)擴(kuò)增了Tc-stp-1全長(zhǎng)基因，序列長(zhǎng)度為1192 bp，含有完整的編碼區(qū)序列（coding sequence,CDS）942 bp，5’端非翻譯區(qū)

7、（untranslated regions,UTR）和3’UTR。Tc-stp-1基因編碼312個(gè)氨基酸殘基（amino acid residues,aa），其金屬離子結(jié)合位點(diǎn)為G61、Y67、D93、T125、L175、V250，活性位點(diǎn)為G61、Y67、D93、T125、S126、L175、V250。多重序列分析表明 Tc-stp-1編碼的氨基酸序列與羅阿絲蟲（Loa loa）、布魯馬來(lái)絲蟲（Brugia malay）、豬蛔蟲（As

8、caris suum）、有齒食道口線蟲（Oesophagostomum dentatum）、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）以及毛圓線蟲（Trichostrongylus vitrines）的PP1氨基酸序列在GDXHG、GDXVDRG、GNHE等基序處完全保守，但序列兩端差異較大。系統(tǒng)發(fā)育分析表明Tc-stp-1編碼的氨基酸序列與L.loa和B.malayi的PP1催化亞基（PP1 catalytic subu

9、nit,PP1c）的氨基酸序列相似性最高。結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Tc-stp-1編碼的蛋白質(zhì)為TcPP1cα，其結(jié)合位點(diǎn)為D90、R94、N122、H123、R220、H247，分子功能為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（GO:0004871），生物學(xué)過(guò)程為蛋白去磷酸化（GO:0006470），細(xì)胞組分為細(xì)胞質(zhì)（GO:0005829）。
　　2.TcPP1cα的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　本研究克隆了Tc-stp-1完整CDS序列，構(gòu)建了Tc

10、-stp-1/pET28a（+）重組表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示載體插入序列長(zhǎng)度為948 bp（包括酶切位點(diǎn)識(shí)別序列）。利用Escherichia coli BL21（DE3）原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了重組蛋白TcPP1cα的外源表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，重組TcPP1cα以包涵體形式表達(dá)，大小約為30 KD。對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后，以0.4 mM IPTG誘導(dǎo)，在37℃培養(yǎng)條件下獲得大量包涵體形式目的蛋白。采用鎳離子親和層析（Ni-NTA）

11、技術(shù)純化目的蛋白，以1M咪唑洗脫時(shí)獲得高純度目的蛋白，制備了兔抗TcPP1cα多克隆抗體。經(jīng)檢測(cè)，該兔抗TcPP1cα多克隆抗體蛋白濃度0.51 mg/mL，滴度>1:256000，純度高于95％。免疫印跡（Western blot）試驗(yàn)結(jié)果顯示條帶單一，表明兔抗TcPP1cα多克隆抗體的特異性好。
　　3.Tc-stp-1的特異性表達(dá)和TcPP1cα的特異性分布
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative rea

12、l-time PCR,qRT-PCR）技術(shù)對(duì)Tc-stp-1在T.canis雌蟲、雄蟲以及蟲體各組織中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明Tc-stp-1在T.canis雄蟲中特異性表達(dá)，其中雄蟲輸精管中Tc-stp-1的轉(zhuǎn)錄水平最高，精巢中Tc-stp-1的轉(zhuǎn)錄水平次之。同時(shí)，利用兔抗TcPP1cα多克隆抗體，采用間接熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)（indirect fluorescence immunohistochemical analysis）

13、對(duì)TcPP1cα在雄蟲各組織的分布情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示TcPP1cα特異性地分布于雄蟲生殖組織，且主要集中于精巢和輸精管，以及精巢和輸精管中的各階段精細(xì)胞。Tc-stp-1在T.canis雄蟲生殖組織中的特異表達(dá)以及TcPP1cα在雄蟲生殖組織的分布表明Tc-stp-1可能參與T.canis的繁殖相關(guān)過(guò)程。
　　4.TcPP1cα的亞細(xì)胞分布
　　本研究克隆了Tc-stp-1完整CDS序列，構(gòu)建了Tc-stp-1/pSL

14、1180重組表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示載體插入序列長(zhǎng)度為950 bp（包括酶切位點(diǎn)識(shí)別序列）。利用sf9細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了重組蛋白TcPP1cα的外源表達(dá)，采用間接熒光免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（indirect fluorescenceimmunocytochemical analysis）檢測(cè)了TcPP1cα重組蛋白在sf9細(xì)胞中的分布情況。結(jié)果表明，TcPP1cα重組蛋白分布于分裂間期sf9細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和分裂期sf9細(xì)胞的紡錘體中間位置（赤

15、道板）。TcPP1cα的亞細(xì)胞分布表明Tc-stp-1可能參與T.canis的細(xì)胞分裂過(guò)程。
　　5.Tc-stp-1的RNA干擾研究
　　采用雙鏈RNA介導(dǎo)的干擾技術(shù)（double-stranded mediated RNA interference,dsRNAi）阻斷Tc-stp-1基因的轉(zhuǎn)錄－表達(dá)的過(guò)程，利用 qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行了Tc-stp-1基因敲低（gene knock down）分析。結(jié)果顯示，干擾24 h

16、后，T.canis精巢和輸精管中的Tc-stp-1轉(zhuǎn)錄水平明顯降低；干擾48 h后，貯精囊中的Tc-stp-1轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，輸精管中的Tc-stp-1轉(zhuǎn)錄水平回升；干擾72 h后，精巢和貯精囊中的Tc-stp-1轉(zhuǎn)錄水平回升，輸精管中的Tc-stp-1轉(zhuǎn)錄水平超過(guò)對(duì)照組水平。組織切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，干擾24h后，T.canis貯精囊和輸精管中的精細(xì)胞形態(tài)異常；干擾48h后，輸精管中的精細(xì)胞減數(shù)分裂出現(xiàn)異常；干擾72h后，輸精管中異常的