綠僵菌絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶基因MaSnf1和MaHog1的克隆及功能分析.pdf

1、綠僵菌是一類重要的昆蟲病原真菌，它作為生物防治制劑具有環(huán)境安全性好和昆蟲不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)。此外，綠僵菌的寄主廣泛性和廣譜性使得其成為一種研究昆蟲病原真菌侵染寄主過程的重要模式生物。然而，綠僵菌在廣泛施用上也存在一些制約，如受環(huán)境影響大，殺蟲速度較慢等。因此，研究昆蟲病原真菌侵染致病的分子機(jī)制對生物防治具有十分重要的理論意義。昆蟲病原真菌穿透寄主體壁需要蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶等水解酶的降解作用，在昆蟲血腔中也需要酸性海藻糖酶來降解昆蟲體

2、內(nèi)的海藻糖產(chǎn)生葡萄糖為真菌提供生長所需的碳源。然而研究表明，以上大多數(shù)水解酶基因的表達(dá)均受葡萄糖的抑制。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶Snf1在葡萄糖抑制途徑至關(guān)重要，并對某些致病真菌的產(chǎn)孢和毒力有影響。昆蟲病原真菌在侵染期間需要克服外界環(huán)境如熱激和UV-B，寄主昆蟲免疫防御如高滲透壓和氧化應(yīng)激，及行為變化如沙漠飛蝗的行為發(fā)熱等各種壓力。促分裂原活化蛋白激酶Hog1型MAPKs在感應(yīng)環(huán)境變化上起到了重要的作用，并調(diào)節(jié)對各種胞外刺激作出反應(yīng)的發(fā)育

3、和分化過程有關(guān)的基因表達(dá)。
　　本文以綠僵菌為實(shí)驗(yàn)材料，在已知基因組序列的基礎(chǔ)上克隆得到了絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶基因MaSnf1和MaHog1，并采用基因敲除及回復(fù)技術(shù)對這兩個(gè)基因的功能進(jìn)行了分析。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.MaSnf1的克隆及功能分析
　　1.1.MaSnf1的克隆與序列分析
　　根據(jù)已知的綠僵菌基因組和cDNA序列克隆得到絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶基因MaSnf1，登錄號為JQ728

4、546，開放閱讀框?yàn)?199bp，分別在編碼區(qū)420、1340和2054位點(diǎn)含有84、64和117bp的三個(gè)內(nèi)含子。該基因開放閱讀框編碼732個(gè)氨基酸多肽，分子量為82.5kDa，pI為6.69。通過分析序列預(yù)測 MaSnf1與其他壓力-激活蛋白激酶一樣含有保守的特征域——216-244位點(diǎn)的活化環(huán)（A-loop）——與激酶活性有關(guān)的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)MaSnf1序列的生物學(xué)分析可知綠僵菌MaSnf1基因編碼的蛋白屬于SNF

5、1/AMPK家族。
　　1.2.采用基因敲除和回復(fù)技術(shù)對MaSnf1進(jìn)行功能分析
　　為了研究綠僵菌 MaSnf1基因的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了敲除載體pK2-PB-MaSnf1L/R和回復(fù)載體pK2-Sur-MaSnf1。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的電轉(zhuǎn)化方法獲得敲除菌株和回復(fù)菌株。然后通過PCR和Southern blot技術(shù)對敲除菌株和回復(fù)菌株進(jìn)行驗(yàn)證。
　　1.3.MaSnf1與綠僵菌的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)有關(guān)
　　在PD

6、A固體培養(yǎng)基上，敲除轉(zhuǎn)化子（ΔMaSnf1）菌落大小顯著小于野生型（WT）和回復(fù)轉(zhuǎn)化子（CP）。通過測量統(tǒng)計(jì)，ΔMaSnf1的產(chǎn)孢量與WT和CP相比降低了50％左右，ΔMaSnf1的萌發(fā)率中時(shí)（GT50）延遲了約1.4h。說明MaSnf1與綠僵菌的產(chǎn)孢量和萌發(fā)有關(guān)。
　　1.4.MaSnf1與綠僵菌的抗逆性有關(guān)
　　在PDA固體培養(yǎng)基上，每一菌株通過UV-B和45℃熱激處理0h、2h、4h和6h后于28℃繼續(xù)培養(yǎng)20h。結(jié)果

7、顯示，隨著 UV-B和熱激時(shí)間的增加，ΔMaSnf1的萌發(fā)率顯著低于WT和CP。說明MaSnf1的缺失增強(qiáng)了綠僵菌對UV-B和熱激的敏感性。
　　1.5.MaSnf1與碳源利用有關(guān)
　　為了研究MaSnf1在綠僵菌碳源利用中的作用，各菌株培養(yǎng)于含有不同單一碳源（葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、半乳糖、海藻糖和麥芽糖）的液體貧瘠培養(yǎng)基（MM）中，發(fā)現(xiàn)在海藻糖和木糖作為唯一碳源的MM中ΔMaSnf1的生長與WT和CP相比顯著

8、減弱。說明MaSnf1與碳源利用有關(guān)。
　　1.6.MaSnf1缺失后降低了綠僵菌的毒力
　　以蝗蟲作為寄主實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了體表接種和體內(nèi)注射兩種毒力測試，結(jié)果顯示ΔMaSnf1的毒力顯著降低，但并沒有完全失去致病性?？梢灶A(yù)測MaSnf1影響綠僵菌對寄主的體壁穿透和體內(nèi)定殖過程。
　　1.7.MaSnf1影響綠僵菌在寄主血淋巴中的生長
　　為了研究MaSnf1對綠僵菌蟲菌體在血淋巴中的分化和生長，我們對各菌株在昆蟲

9、血淋巴中的生長表型進(jìn)行了活體和離體實(shí)驗(yàn)。觀察發(fā)現(xiàn)體表接種6d后，蝗蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)了大量的WT和CP蟲菌體，但幾乎沒有發(fā)現(xiàn)ΔMaSnf1蟲菌體。8d后在血淋巴中發(fā)現(xiàn)了大量的ΔMaSnf1蟲菌體。體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了相似的情況。顯微觀察各菌株在含有或不含血細(xì)胞的血淋巴中的離體培養(yǎng)情況，發(fā)現(xiàn)ΔMaSnf1蟲菌體的生長弱于WT和CP。
　　1.8.MaSnf1影響綠僵菌在蝗蟲后翅上的孢子萌發(fā)和附著胞形成
　　由于毒力測試發(fā)現(xiàn)MaSn

10、f1影響綠僵菌體壁穿透過程，所以我們在蝗蟲后翅上進(jìn)行了孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的測定。結(jié)果顯示，雖然各菌株的芽管和附著胞在形態(tài)上相似，但ΔMaSnf1的孢子萌發(fā)和附著胞形成時(shí)間與WT和CP相比延遲了，并且附著胞形成率降低了50%左右。說明MaSnf1影響綠僵菌在蝗蟲后翅上的孢子萌發(fā)和附著胞形成。
　　1.9.MaSnf1影響綠僵菌某些水解酶基因的表達(dá)
　　用qRT-PCR技術(shù)定量綠僵菌某些水解酶基因的表達(dá)量。通過定量統(tǒng)計(jì)分析

11、，發(fā)現(xiàn)在附著胞形成時(shí)期，ΔMaSnf1中幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的表達(dá)量與WT相比顯著降低；在蝗蟲體內(nèi)定殖時(shí)期，ΔMaSnf1中酸性海藻糖酶（ATM）基因的表達(dá)量與WT相比顯著降低。說明MaSnf1影響綠僵菌某些水解酶基因的表達(dá)。
　　2.MaHog1的克隆及功能分析
　　2.1.MaHog1的克隆及序列分析
　　根據(jù)已知的綠僵菌全基因組信息，我們克隆得到了一個(gè)基因MaHog1。該基因登錄號為JQ691634，開放閱讀框?yàn)?0

12、77bp，編碼358個(gè)氨基酸，分子量為41.1kDa，pI為5.65。在MaHog1基因組DNA的57，181，376，487，640，1053，1200和1445編碼區(qū)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了76，65，67，53，56，68，61和53bp的共八個(gè)內(nèi)含子。分析序列可知 MaHog1含有保守的壓力激活蛋白激酶子域——171-173位點(diǎn)的TGY活化環(huán)——與激酶活性有關(guān)的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)MaHog1序列的生物學(xué)分析可知綠僵菌MaHog1基

13、因編碼的蛋白屬于Hog1/Sty1/p38MAPK家族。
　　2.2.采用基因敲除和回復(fù)技術(shù)對MaHog1進(jìn)行功能分析
　　為了研究綠僵菌 MaHog1基因的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了敲除載體pK2-PB-MaHog1L/R和回復(fù)載體pK2-Sur-MaHog1。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的電轉(zhuǎn)化方法獲得敲除菌株和回復(fù)菌株并通過PCR和Southern blot技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　2.3.MaHog1與綠僵菌對于高滲、氧化應(yīng)激和高溫

14、耐受性及細(xì)胞壁抑制劑的敏感性有關(guān)
　　為了研究MaHog1對多種壓力的反應(yīng)，我們觀察了在各種壓力下的菌落形態(tài)。當(dāng)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，各菌株之間的生長速率沒有顯著差異。在高滲透壓條件下（PDA加入0.5M NaCl或1.5M sorbitol），ΔMaHog1的生長減弱。而且，與WT和CP相比，ΔMaHog1增強(qiáng)了對高溫（35℃）和氧化應(yīng)激壓力（6mM H2O2）的耐受性，且ΔMaHog1對細(xì)胞壁抑制劑剛果紅（CR）和熒光增白劑

15、（CFW）產(chǎn)生了顯著抗性。說明 MaHog1與綠僵菌對于高滲、氧化應(yīng)激和高溫耐受力及細(xì)胞壁抑制劑的敏感性有關(guān)。
　　2.4.MaHog1缺失后降低了綠僵菌的毒力
　　為了研究 MaHog1對毒力的影響，我們進(jìn)行了體表侵染和體內(nèi)注射兩種毒力測試。結(jié)果顯示ΔMaHog1的毒力顯著降低，但并沒有完全失去致病性?？梢灶A(yù)測MaHog1影響綠僵菌對寄主的體壁穿透和體內(nèi)定殖過程。
　　2.5.MaHog1影響綠僵菌在寄主昆蟲血淋巴中

16、的生長
　　為了研究 MaHog1對綠僵菌蟲菌體在血淋巴中的分化和生長，我們對各菌株在昆蟲血淋巴中的生長表型進(jìn)行了活體和離體實(shí)驗(yàn)。觀察發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射5d后，蝗蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)了大量的WT和CP蟲菌體，但幾乎沒有發(fā)現(xiàn)ΔMaHog1蟲菌體。8d后在血淋巴中發(fā)現(xiàn)了大量的ΔMaHog1蟲菌體。體表侵染實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了相似的情況。對各菌株在血淋巴中的離體培養(yǎng)情況進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)ΔMaHog1蟲菌體數(shù)量顯著少于WT和CP。說明MaHog1影響綠僵菌在