水稻RING指蛋白基因OsBIRF1和類(lèi)絲氨酸羧肽酶基因OsBISCPL1的功能分析.pdf

1、植物抗病反應(yīng)的調(diào)控涉及到復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及眾多蛋白因子的協(xié)同作用。在研究水稻誘導(dǎo)免疫分子機(jī)理的過(guò)程中，分離鑒定了2個(gè)與水稻抗病反應(yīng)相關(guān)的cDNA克隆BIHN-w1和BNHN-w3，分別編碼RING-H2型RING指蛋白和絲氨酸羧肽酶類(lèi)蛋白。本研究中，我們克隆了這2個(gè)cDNA克隆所代表的基因，OsBlRF1和OsBISCPL1，并研究了其生物學(xué)功能。 OsBIRF1基因全長(zhǎng)為1873 bp，包含一個(gè)1191 bp的ORF，編碼一

2、個(gè)396個(gè)氨基酸的蛋白，含有一個(gè)高度保守的RING-H2型RING指結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)水稻RING-H2型RING指蛋白。OsBIRF1位于水稻第2條染色體上，不含內(nèi)含子。RT-PCR結(jié)果分析表明，苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)、水楊酸(salicylic acid，SA)、ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)和茉莉酸(jasmonic acid，JA)等抗病信號(hào)分子能

3、激活OsBIRF1的表達(dá)；在水稻與稻瘟病菌的非親和性互作反應(yīng)中OsBIRF1表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)表達(dá)，而在親和性互作的感病水稻幼苗中只檢測(cè)到相對(duì)較低水平的基礎(chǔ)表達(dá)。為了進(jìn)一步研究OsBIRF1在抗病反應(yīng)中的功能，我們將OsBIRF1基因?qū)霟煵?，獲得10株轉(zhuǎn)OsBIRFl基因T0代煙草植株，其中5個(gè)株系(3，4，5，8，15)為單拷貝插入。RT-PCR結(jié)果分析表明所檢測(cè)的OsBIRF1轉(zhuǎn)基因煙草植株都能夠正常表達(dá)。OsBIRF1轉(zhuǎn)基因煙草植

4、株不僅在長(zhǎng)勢(shì)方面比非轉(zhuǎn)基因植株好，且明顯提高了對(duì)煙草花葉病毒病和煙草野火病的抗性，誘導(dǎo)了煙草防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因PR-1、PR-2、PR-3和PR-5的上調(diào)表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)OsBIRF1基因煙草植株降低了對(duì)ABA的敏感性，提高了對(duì)氧化脅迫和干旱的抗性，但其抗鹽性沒(méi)有明顯的變化。這些結(jié)果表明OsBIRF1在激活水稻抗病及抗逆反應(yīng)中起作用。 OsBISCPL1基因全長(zhǎng)cDNA為1747 bp，包含一個(gè)大小為1407 bp的ORF。OsBI

5、SCPL1位于水稻第8號(hào)染色體上，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成，在水稻基因組中以單拷貝的形式存在。OsBISCPL1編碼一個(gè)由468個(gè)氨基酸組成的蛋白，屬于類(lèi)絲氨酸羧肽酶，其N(xiāo)-端1～29個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，31～465個(gè)氨基酸是S10家族的肽酶序列，其中IvAESYGG是所有絲氨酸羧肽酶高度保守的絲氨酸活性位點(diǎn)。OsBISCPL1蛋白與擬南芥SCPL51遺傳距離較近，在氨基酸水平上有53.6％的一致性。OsBISCPL1基因在水

6、稻中的表達(dá)存在組織差異性，在根、葉和幼穗中表達(dá)量高，而在莖中較低。基因表達(dá)分析表明，BTH、SA、ACC和JA等抗病信號(hào)分子能激活OsBISCPL1基因的表達(dá)，在水稻與稻瘟病菌的非親和性互作反應(yīng)中OsBISCPL1基因上調(diào)表達(dá)。 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸蘸法將OsBISCPL1導(dǎo)入擬南芥植株，獲得13株轉(zhuǎn)OsBISCPL1基因T1代擬南芥株系，其中5個(gè)株系為單拷貝插入。RT-PCR分析結(jié)果表明OsBISCPL1在所檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因

7、擬南芥T2代單拷貝植株中都能夠正常表達(dá)。抗病性測(cè)定表明，OsBISCPL1轉(zhuǎn)基因植株提高對(duì)Alternaria brassicicola、Pseudomonas syringae pv．tomato的抗性，而且這些轉(zhuǎn)基因植株中防衛(wèi)相關(guān)基因PR-1、PR-2、PR-5和PDF1.2都有組成型增強(qiáng)表達(dá)。 OsBISCPL1轉(zhuǎn)基因植株在一定程度上降低了ABA敏感性，但對(duì)氧化脅迫表現(xiàn)出一定抗性。這些結(jié)果表明OsBISCPL1編碼了一個(gè)水稻絲氨酸