中間偃麥草天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1的功能分析.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈N植最廣泛的農(nóng)作物之一，全球大約1/3的人口以小麥為主食。但是，小麥白粉病和赤霉病一直是影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因素。因此，挖掘新的抗病基因，培育出含有多個抗病基因聚合的抗病小麥品種是目前亟待解決的問題。
　　在前期研究中，從小偃麥異附加系SN6306（高感白粉的小麥品種煙農(nóng)15與中間偃麥草雜交后代）中克隆到了一個與白粉病抗性相關(guān)的天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1。本研究以天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1為研究對象，對TiA

2、P1基因的功能及作用機制進行分析，主要結(jié)果如下：
　　（1）TiAP1蛋白的生物信息學(xué)分析
　　目的蛋白為天冬氨酸蛋白酶，通過對跨膜螺旋進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，因此不是跨膜蛋白。同時對蛋白的許多物理化學(xué)特性進行了分析，目的蛋白含有506個氨基酸，等電點為5.6，含有信號肽，信號肽的切割位點位于第16和17個氨基酸之間。除此之外還對蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中延伸鏈和無規(guī)則卷曲所占的比例較

3、高，三級結(jié)構(gòu)構(gòu)建的模型比較穩(wěn)定。
　?。?）原核表達系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)的功能分析
　　利用本實驗室現(xiàn)有的 pET-28a載體與密碼子優(yōu)化后的目的序列構(gòu)建原核表達載體pET-AP，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中，加入IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達，37℃誘導(dǎo)過夜，利用SDS-PAGE電泳，在45KD附近出現(xiàn)了目的條帶。利用Western blot對目的蛋白進行檢測，證明誘導(dǎo)表達成功。利用親和層析，在將目的蛋白分離純化出來的過程中，發(fā)現(xiàn)目的蛋白表

4、達是以包涵體的形式。將目的蛋白純化復(fù)性后進行白粉病菌孢子和赤霉病菌孢子的萌發(fā)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白會抑制白粉病菌和赤霉病菌的孢子的萌發(fā)，
　?。?）TiAP1蛋白作用機制分析
　　通過分生孢子萌發(fā)實驗，發(fā)現(xiàn) TiAP1蛋白可以影響白粉病菌和禾谷鐮刀菌分生孢子的萌發(fā)。為了進一步確定目的蛋白的作用機制，將禾谷鐮刀菌的菌絲和分生孢子分別放入蛋白儲存液、低濃度（0.146mg/ml）蛋白、高濃度（0.291mg/ml）蛋白溶液中孵育

5、，孵育結(jié)束后，加入熒光染料 SYTOX Green，觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛋白儲存液中孵育之后的菌絲和分生孢子加入熒光染料之后也沒有熒光產(chǎn)生；經(jīng)過低濃度蛋白溶液孵育后的菌絲和孢子，在顯微鏡下菌絲和分生孢子帶有微弱的熒光；高濃度的蛋白溶液中熒光增強。以上結(jié)果說明TiAP1蛋白可以增加細(xì)胞膜的通透性。
　?。?）轉(zhuǎn)基因小麥對白粉病菌的抗性鑒定
　　本實驗室前期研究中得到了轉(zhuǎn)基因BobWhite小麥，進行小麥白粉病菌E09的苗期抗病性鑒

6、定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥植株葉片上的孢子數(shù)明顯少于對照。說明 TiAP1基因可能會延緩白粉病的侵染速度。此外，為了進一步探究 TiAP1基因可能參與的抗白粉病的途徑，通過白粉病菌誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因小麥中茉莉酸甲酯的標(biāo)記基因OPDA、PR10、COL1標(biāo)記基因跟0h和對照相比，表達量明顯上調(diào)，其中PR10的表達量上調(diào)最多，是0h的20倍左右。這些結(jié)果表明TiAP1基因可能參與了茉莉酸激素調(diào)節(jié)途徑。
　?。?）轉(zhuǎn)基因擬南芥對Pst DC3000響