龍葵類枯草桿菌蛋白酶SaSBT1的基因克隆與功能分析.pdf

1、類枯草桿菌蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶S8家族，廣泛存在于各個(gè)物種中。在本研究中，作者使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法克隆了龍葵類枯草桿菌蛋白酶SaSBT1全長(zhǎng)cDNA，并在大腸桿菌中進(jìn)行了原核蛋白表達(dá)與純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SaSBT1蛋白酶的酶原在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，并在特定的pH下進(jìn)行了自我活化。短時(shí)間的高溫孵育可以明顯地促進(jìn)該酶的活化。在特性條件下活化之后的蛋白酶SaSBT1顯示了對(duì)caspase-1/3/6底物A

2、c-YVAD-MCA，Ac-DEVD-AMC和Ac-IETD-MCA的高度活性，其Vmax值分別達(dá)到了10.99、3.95和1.05 nmol/min/μg，而其Km值分別為682.4、43.2和28.2μM，其酶動(dòng)力學(xué)相關(guān)數(shù)值接近于動(dòng)物中的caspase或先前報(bào)道的植物中與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)的液泡蛋白酶VPE。與動(dòng)物的caspase類似，SaSBT1對(duì)caspase-1底物Ac-YVAD-MCA的活性可以被相應(yīng)的抑制劑Ac-YVAD-

3、CHO有效抑制，然而不能被絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF抑制。上述發(fā)現(xiàn)證明先前眾多研究者所觀察到的植物中caspase-like活性至少部分可能來自植物的subtilase家族蛋白酶。與此同時(shí)，作者還研究了一系列的蛋白酶抑制劑、各種pH、以及各種鹽濃度對(duì)SaSBT1的酶活性和其他生化性質(zhì)的影響。
　　 為了研究SaSBT1在植物體內(nèi)的表達(dá)情況，作者構(gòu)建了SaSBT1啟動(dòng)子與報(bào)告基因β-葡萄糖苷酸酶(GUS)融合基因植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)

4、化龍葵，得到了轉(zhuǎn)基因植株。GUS染色結(jié)果顯示，SaSBT1的啟動(dòng)子特異地驅(qū)使GUS基因在轉(zhuǎn)基因龍葵的莖幼嫩部位的表皮、葉脈以及莖表皮細(xì)胞等組織特異表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示SaSBT1 cDNA可以從莖、葉以及果實(shí)制備的cDNA中特異性地得到擴(kuò)增，這一結(jié)果與GUS染色結(jié)果相吻合。在煙草BY-2細(xì)胞中超量表達(dá)SaSBT1，可以加速細(xì)胞在55℃熱激處理之后的死亡速度。這表明，SaSBT1可能和動(dòng)物caspase一樣，在植物細(xì)胞的死亡過程中發(fā)