解淀粉芽孢桿菌與其誘變菌株酶系分析和蛋白酶基因克隆表達(dá).pdf

1、本論文的主要研究內(nèi)容包含以下幾點(diǎn)：
　　通過培養(yǎng)菌株NCU116與誘變菌株NCU116-1，并對(duì)其菌落形態(tài)及其在掃描電鏡下的形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)菌株誘變前后的菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)基本變化不大。菌落呈圓形、外表光滑，顏色為淺黃色、邊緣有不規(guī)則波狀突起。用分析型掃描電子顯微鏡下觀察，菌株形態(tài)為桿狀，表面光滑，呈鈍圓形態(tài)，較細(xì)長，單個(gè)或多個(gè)首尾相連排列。結(jié)果表明，對(duì)于某些菌株，物理化學(xué)誘變對(duì)其分泌胞外酶的基因產(chǎn)生影響較大，使控制胞外酶性狀的

2、DNA發(fā)生了一定程度的突變，而對(duì)其菌落和細(xì)胞形態(tài)并無引起較大改變。
　　通過搖瓶培養(yǎng)的方式對(duì)菌株NCU116和NCU116-1進(jìn)行培養(yǎng)，使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法、CMC-Na法等對(duì)胞外酶進(jìn)行分析。結(jié)果表明菌株胞外酶系包括：蛋白酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶。并確定了各個(gè)胞外酶活力與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系及其最佳發(fā)酵時(shí)間。結(jié)果表明：
　　菌株NCU116，搖瓶發(fā)酵44h時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶活力最高，分別為4536.5U/mL和4.

3、8U/mL；糖化酶的活力最高值（4070.9U/mL）出現(xiàn)在搖瓶38h時(shí)；發(fā)酵42h時(shí)，果膠酶和纖維素酶活力最高，分別為875.3U/mL和57.0U/mL。誘變菌株NCU116-1，搖瓶44h時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶活力最高，為9027.0U/mL；果膠酶在搖瓶42h活力最高（1944.2U/mL），糖化酶，淀粉酶，纖維素酶在搖瓶40小時(shí)活力最高（分別是10727.6U/mL，6.3U/mL和29.2U/mL）。
　　使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法

4、、CMC-Na法等對(duì)解淀粉芽孢桿菌NCU116與NCU116-1胞外酶系的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：
　　原始菌株NCU116所產(chǎn)的蛋白酶在50℃下的酶活力最高，其最適作用溫度為40-45℃、最適作用pH值為7.0，Mn2+對(duì)其有激活作用；糖化酶在45℃下的酶活力最高，其最適作用溫度為40-45℃、最適作用pH值為6.0，Ca2+對(duì)其有激活作用；果膠酶在40℃下的酶活力最高，其最適作用溫度為35-40℃、最適作用pH值為7.0，

5、Ca2+對(duì)其有激活作用；纖維素酶在35℃下的酶活力最高，其最適作用溫度為35-40℃、最適作用pH值為7.0，Ca2+對(duì)其酶活有微弱促進(jìn)作用。
　　誘變菌株NCU116-1所產(chǎn)蛋白酶在50℃時(shí)活力最高，Mn2+對(duì)其有激動(dòng)作用，最適宜酶解溫度為40-45℃、適宜酶解pH為8.0；糖化酶在35℃時(shí)活力最高，Cu2+對(duì)其有激動(dòng)作用，最適宜酶解溫度為35℃左右、適宜酶解pH為8.0；果膠酶在40℃時(shí)活力最高，Ca2+對(duì)其有激動(dòng)作用，最適宜

6、酶解溫度為35-40℃、適宜酶解pH為6.0；纖維素酶在50℃時(shí)活力最高，Cu2+對(duì)其有活力有促進(jìn)作用，最適宜酶解溫度為40-45℃，適宜酶解pH為7.0。
　　以解淀粉芽孢桿菌NCU116作為研究對(duì)象，對(duì)其蛋白酶基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)與純化。通過基因克隆方法，得到了一條長度為1494bp的蛋白酶基因，經(jīng)Blast序列分析可知，該基因與Bacillus amyloliquefaciens中性蛋白酶基因（Sequence ID: K0

7、2497.1）有99％的同源性。蛋白酶目的基因所編碼的蛋白理論分子量（Molecular weight）為52.85kDa，等電點(diǎn)pl=8.25，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）數(shù)目為53個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）數(shù)目為51個(gè)。不穩(wěn)定系數(shù)（The instability index）為25.93，表明該蛋白穩(wěn)定性比較好。280nm處消光系數(shù)為59710M-1 cm-1。脂肪系數(shù)為71.33，總平均親水性為-0.658。該蛋