苛求芽孢桿菌尿酸酶的表征、應(yīng)用與其基因克隆.pdf

1、測(cè)定血清尿酸是臨床檢驗(yàn)常規(guī)工作之一。利用尿酸酶的高專一性進(jìn)行酶法分析測(cè)定血清尿酸含量，即尿酸酶法，是目前常規(guī)測(cè)定血清尿酸的主要方法?，F(xiàn)有尿酸酶法中，過氧化物酶偶聯(lián)尿酸酶的間接終點(diǎn)平衡法最常用，但此終點(diǎn)平衡法受血清中還原物質(zhì)和過氧化物，及黃嘌呤等的顯著干擾。本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)家自然科學(xué)基金(30200266)資助下，建立了血清尿酸含量測(cè)定的專利方法(zl03135649．4)，此專利方法對(duì)血清中常見干擾物質(zhì)不敏感；與其它尿酸酶法相比，相同效率下

2、其成本最低，線性范圍最寬，對(duì)黃嘌呤抗性最強(qiáng)。已報(bào)道尿酸酶法中，測(cè)定尿酸酶作用下紫外吸收總變化的直接終點(diǎn)平衡法對(duì)常見干擾抗性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)室的專利方法與直接終點(diǎn)平衡法一致，但與最常用的過氧化物酶偶聯(lián)尿酸酶間接終點(diǎn)平衡法不一致?？梢姶藢＠椒尚星铱煽俊５藢＠椒ㄐ枰狵m較高且對(duì)黃嘌呤抑制不敏感的工具尿酸酶。目前市售尿酸酶Km都較低且對(duì)黃嘌呤敏感。另一方面，尿酸酶也是當(dāng)前治療高尿酸血癥相關(guān)疾病的理想藥物?？燎笱挎邨U菌依賴于高濃度尿酸而生長(zhǎng)，

3、其可表達(dá)高比活性的胞內(nèi)和胞外尿酸酶；此類尿酸酶Km較高，最接近我們專利方法要求；但至今未見關(guān)于此物種的任何基因序列信息報(bào)道。為獲得廉價(jià)且符合要求尿酸酶以促進(jìn)測(cè)定血清尿酸含量專利方法的應(yīng)用，并進(jìn)一步開發(fā)治療高尿酸血癥的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)藥物，本項(xiàng)目對(duì)苛求芽孢桿菌的胞內(nèi)外尿酸酶進(jìn)行了下列研究： 1．苛求芽孢桿菌胞外尿酸酶用于此專利方法測(cè)定尿酸的評(píng)價(jià) 用高尿酸誘導(dǎo)培養(yǎng)苛求芽孢桿菌(ATCC26904)，所分泌胞外尿酸酶經(jīng)硫酸銨沉淀和

4、DEAE-cellulose52層析，就可用于此專利方法通過預(yù)測(cè)反應(yīng)體系紫外吸收本底，動(dòng)力學(xué)法測(cè)定血清尿酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此尿酸酶含34．7M單一肽鏈，Km為(O．22±0．01)mmol／L(n=11)，黃嘌呤抑制常數(shù)為(36±3)p,mol／L(n=4)。此尿酸酶用于我們的專利方法，只要被分析數(shù)據(jù)終點(diǎn)對(duì)應(yīng)底物濃度低于被分析起點(diǎn)底物濃度的35％，就能可靠預(yù)測(cè)本底。通過直接測(cè)定酶作用前吸收，此直接動(dòng)力學(xué)法對(duì)常見干擾、酶活性變化和15gmol

5、／L黃嘌呤有抗性。用0．025U／mi尿酸酶監(jiān)測(cè)反應(yīng)5min內(nèi)數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)測(cè)定下限為1μmol／L，上限接近50μmol／L，所得臨床標(biāo)本尿酸含量(CdO與過氧化物酶偶聯(lián)間接終點(diǎn)平衡法(Cie)緊密正相關(guān)(Cdk=-0．008+1．046xCie，r>0．996，n=206)，但Bland-altman分析表明其與過氧化物酶偶聯(lián)尿酸酶的間接終點(diǎn)平衡法不一致。因此，此苛求芽孢桿菌胞外尿酸酶能用于直接動(dòng)力學(xué)尿酸酶法測(cè)定血清尿酸含量，并保障其優(yōu)勢(shì)

6、。但此酶制劑含有色素，須高純度才能用于此專利方法，而且此酶可能含有金屬離子輔助因子，重組表達(dá)難度也較大。 2．苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶用于專利方法測(cè)定血清尿酸的評(píng)價(jià) 用高尿酸誘導(dǎo)培養(yǎng)苛求芽孢桿菌(ATCC26904)，離心收集菌體，超聲破碎，離心后上清液經(jīng)DEAE-cellulose52層析，再經(jīng)過制備性凝膠電泳純化后純度達(dá)95％。用SephadexG-200凝膠過濾層析測(cè)得有活性天然尿酸酶分子量為151kd，SDS-PA

7、GE發(fā)現(xiàn)其由35．7kd單一肽鏈組成，MALDI-TOF-MS分析發(fā)現(xiàn)其只有35．983kd的主峰，用Edman降解法測(cè)得該尿酸酶的N．端氨基酸序列為AERTMFYGKGDV。此酶對(duì)水透析后解離成二聚體而失去活性。該尿酸酶最適pH為9．0-10．5：pH為9．2時(shí)Km為(204士14)gmol／L(n=8)，黃嘌呤抑制常數(shù)為(41~7)grnol／L(n=5)。此尿酸酶用于直接動(dòng)力學(xué)尿酸酶法，分析0．03U／ml尿酸酶反應(yīng)5min內(nèi)的數(shù)

8、據(jù)可預(yù)測(cè)本底，在反應(yīng)體系中尿酸測(cè)定下限達(dá)到1μmol／L，上限接近50μmol／L，且對(duì)反應(yīng)體系中30μmol／L的黃嘌呤干擾有抗性。所得臨床標(biāo)本尿酸含量(CaA)與過氧化物酶偶聯(lián)雙試劑間接終點(diǎn)平衡法(Cie)緊密正相關(guān)(Cie=0．017+0．919×cak，r>0．998，n=189)，與測(cè)定尿酸酶作用下紫外吸收總變化的直接終點(diǎn)平衡法(Cae)也緊密正相關(guān)(Cak=一0．018+1．007×Cae,r>0．998，n=189)，間接

9、終點(diǎn)平衡法(Cie)和直接終點(diǎn)平衡法(Cde)也緊密正相關(guān)(Cie=-0．001+0．927×Cde，r>0．997，n=l89)。Bland-Akltman分析表明，此專利方法與直接終點(diǎn)平衡法一致，而與間接終點(diǎn)平衡法不一致。用此苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶，此專利動(dòng)力學(xué)尿酸酶法比其它尿酸酶法線性范圍更寬，相同效率下成本最低，抗干擾能力更強(qiáng)，尤其對(duì)黃嘌呤的抗性為最強(qiáng)。此胞內(nèi)酶不含色素，用于此專利尿酸酶法測(cè)定血清尿酸含量更合適，而且此酶不需金屬

10、輔助因子，也容易實(shí)現(xiàn)其重組表達(dá)。 3．苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶的基因克隆 用BLAST(searchforshort，nearlyexactlymmhches模塊)搜尋NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)該尿酸酶N端已知序列與BacillushaloduransC-125的N端相似性最高，與Bacillussp．TB-90相似性次之；來自細(xì)菌的活性尿酸酶含有310～340個(gè)氨基酸殘基。對(duì)相似性最高的幾種細(xì)菌尿酸酶進(jìn)行多序列聯(lián)配比對(duì)分析，發(fā)

11、現(xiàn)細(xì)菌尿酸酶有兩個(gè)保守肽段：MN端約70個(gè)氨基酸處存在ATDSMKNFI保守肽段，距N端約290個(gè)氨基酸處存在GKVYTEPR保守肽段(以Bacillussp．TB-90尿酸酶的氨基酸序號(hào)為參考)。據(jù)已知N端序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物作為5端引物，針對(duì)兩處的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物為3端引物，分別組合后優(yōu)化退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了來自基因組DNA的多個(gè)片段；所得DNA片段經(jīng)T載體連接，轉(zhuǎn)化后藍(lán)白斑篩選，陽性克隆初步驗(yàn)證插入序列后，測(cè)序得N端75

12、個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)基因片段；BLASTp搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)其與Bacillussp．TB-90尿酸酶N端片段的相似性最高；同時(shí)，在用N端已知序列對(duì)應(yīng)簡(jiǎn)并引物和針對(duì)下游保守序列簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR克隆所得片段中，意外地發(fā)現(xiàn)了從距天然蛋白N端59個(gè)氨基酸殘基到翻譯終止密碼子下游的全序列；通過針對(duì)已知序列的全長(zhǎng)克隆，確認(rèn)了從第5位氨基酸到終止密碼之間的編碼區(qū)基因序列，翻譯后發(fā)現(xiàn)該尿酸酶總共含322個(gè)氨基酸殘基，分子量35．757kd；用BLAST

13、p搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，其序列與Bacillussp．TB-90尿酸酶序列相似性最高(＞57％)，同Bacillussubtilissubsp．subtilisstr.l68尿酸酶序列相似性排第二，與BacillusclausiiKSM-K16尿酸酶序列相似性排第三，與BacillushaloduransC．125尿酸酶的序列相似性排第四；在此尿酸酶靠近N端70個(gè)氨基酸殘基附近存在上述細(xì)菌尿酸酶中保守序列ATDSMKNFI，而其他細(xì)菌

14、尿酸酶靠近下游(距離N端約290個(gè)氨基酸處)的另一保守序列，在該尿酸酶變?yōu)镚＃＃＃＃＃＃R，這可能是簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增未能直接得到從N端到此遠(yuǎn)端保守序列對(duì)應(yīng)基因片段的原因。在用簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增時(shí)，還非特異地?cái)U(kuò)增出三個(gè)該菌株的其他蛋白基因片段，序列已提交GenBank(序列號(hào)為DQ464200～464202)。根據(jù)此酶的氨基酸序列，用InsightⅡ下的Homology模塊建立了其三維結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)70個(gè)氨基酸附近的保守序列和N端片斷位