苛求芽孢桿菌尿酸酶的表征、應(yīng)用與其基因克隆.pdf

1、測定血清尿酸是臨床檢驗常規(guī)工作之一。利用尿酸酶的高專一性進行酶法分析測定血清尿酸含量，即尿酸酶法，是目前常規(guī)測定血清尿酸的主要方法?，F(xiàn)有尿酸酶法中，過氧化物酶偶聯(lián)尿酸酶的間接終點平衡法最常用，但此終點平衡法受血清中還原物質(zhì)和過氧化物，及黃嘌呤等的顯著干擾。本實驗室在國家自然科學(xué)基金(30200266)資助下，建立了血清尿酸含量測定的專利方法(zl03135649．4)，此專利方法對血清中常見干擾物質(zhì)不敏感；與其它尿酸酶法相比，相同效率下

2、其成本最低，線性范圍最寬，對黃嘌呤抗性最強。已報道尿酸酶法中，測定尿酸酶作用下紫外吸收總變化的直接終點平衡法對常見干擾抗性最強。本實驗室的專利方法與直接終點平衡法一致，但與最常用的過氧化物酶偶聯(lián)尿酸酶間接終點平衡法不一致?？梢姶藢＠椒尚星铱煽俊５藢＠椒ㄐ枰狵m較高且對黃嘌呤抑制不敏感的工具尿酸酶。目前市售尿酸酶Km都較低且對黃嘌呤敏感。另一方面，尿酸酶也是當前治療高尿酸血癥相關(guān)疾病的理想藥物?？燎笱挎邨U菌依賴于高濃度尿酸而生長，

3、其可表達高比活性的胞內(nèi)和胞外尿酸酶；此類尿酸酶Km較高，最接近我們專利方法要求；但至今未見關(guān)于此物種的任何基因序列信息報道。為獲得廉價且符合要求尿酸酶以促進測定血清尿酸含量專利方法的應(yīng)用，并進一步開發(fā)治療高尿酸血癥的自主知識產(chǎn)權(quán)藥物，本項目對苛求芽孢桿菌的胞內(nèi)外尿酸酶進行了下列研究： 1．苛求芽孢桿菌胞外尿酸酶用于此專利方法測定尿酸的評價 用高尿酸誘導(dǎo)培養(yǎng)苛求芽孢桿菌(ATCC26904)，所分泌胞外尿酸酶經(jīng)硫酸銨沉淀和

4、DEAE-cellulose52層析，就可用于此專利方法通過預(yù)測反應(yīng)體系紫外吸收本底，動力學(xué)法測定血清尿酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此尿酸酶含34．7M單一肽鏈，Km為(O．22±0．01)mmol／L(n=11)，黃嘌呤抑制常數(shù)為(36±3)p,mol／L(n=4)。此尿酸酶用于我們的專利方法，只要被分析數(shù)據(jù)終點對應(yīng)底物濃度低于被分析起點底物濃度的35％，就能可靠預(yù)測本底。通過直接測定酶作用前吸收，此直接動力學(xué)法對常見干擾、酶活性變化和15gmol

5、／L黃嘌呤有抗性。用0．025U／mi尿酸酶監(jiān)測反應(yīng)5min內(nèi)數(shù)據(jù)對應(yīng)測定下限為1μmol／L，上限接近50μmol／L，所得臨床標本尿酸含量(CdO與過氧化物酶偶聯(lián)間接終點平衡法(Cie)緊密正相關(guān)(Cdk=-0．008+1．046xCie，r>0．996，n=206)，但Bland-altman分析表明其與過氧化物酶偶聯(lián)尿酸酶的間接終點平衡法不一致。因此，此苛求芽孢桿菌胞外尿酸酶能用于直接動力學(xué)尿酸酶法測定血清尿酸含量，并保障其優(yōu)勢

6、。但此酶制劑含有色素，須高純度才能用于此專利方法，而且此酶可能含有金屬離子輔助因子，重組表達難度也較大。 2．苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶用于專利方法測定血清尿酸的評價 用高尿酸誘導(dǎo)培養(yǎng)苛求芽孢桿菌(ATCC26904)，離心收集菌體，超聲破碎，離心后上清液經(jīng)DEAE-cellulose52層析，再經(jīng)過制備性凝膠電泳純化后純度達95％。用SephadexG-200凝膠過濾層析測得有活性天然尿酸酶分子量為151kd，SDS-PA

7、GE發(fā)現(xiàn)其由35．7kd單一肽鏈組成，MALDI-TOF-MS分析發(fā)現(xiàn)其只有35．983kd的主峰，用Edman降解法測得該尿酸酶的N．端氨基酸序列為AERTMFYGKGDV。此酶對水透析后解離成二聚體而失去活性。該尿酸酶最適pH為9．0-10．5：pH為9．2時Km為(204士14)gmol／L(n=8)，黃嘌呤抑制常數(shù)為(41~7)grnol／L(n=5)。此尿酸酶用于直接動力學(xué)尿酸酶法，分析0．03U／ml尿酸酶反應(yīng)5min內(nèi)的數(shù)

8、據(jù)可預(yù)測本底，在反應(yīng)體系中尿酸測定下限達到1μmol／L，上限接近50μmol／L，且對反應(yīng)體系中30μmol／L的黃嘌呤干擾有抗性。所得臨床標本尿酸含量(CaA)與過氧化物酶偶聯(lián)雙試劑間接終點平衡法(Cie)緊密正相關(guān)(Cie=0．017+0．919×cak，r>0．998，n=189)，與測定尿酸酶作用下紫外吸收總變化的直接終點平衡法(Cae)也緊密正相關(guān)(Cak=一0．018+1．007×Cae,r>0．998，n=189)，間接

9、終點平衡法(Cie)和直接終點平衡法(Cde)也緊密正相關(guān)(Cie=-0．001+0．927×Cde，r>0．997，n=l89)。Bland-Akltman分析表明，此專利方法與直接終點平衡法一致，而與間接終點平衡法不一致。用此苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶，此專利動力學(xué)尿酸酶法比其它尿酸酶法線性范圍更寬，相同效率下成本最低，抗干擾能力更強，尤其對黃嘌呤的抗性為最強。此胞內(nèi)酶不含色素，用于此專利尿酸酶法測定血清尿酸含量更合適，而且此酶不需金屬

10、輔助因子，也容易實現(xiàn)其重組表達。 3．苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶的基因克隆 用BLAST(searchforshort，nearlyexactlymmhches模塊)搜尋NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該尿酸酶N端已知序列與BacillushaloduransC-125的N端相似性最高，與Bacillussp．TB-90相似性次之；來自細菌的活性尿酸酶含有310～340個氨基酸殘基。對相似性最高的幾種細菌尿酸酶進行多序列聯(lián)配比對分析，發(fā)

11、現(xiàn)細菌尿酸酶有兩個保守肽段：MN端約70個氨基酸處存在ATDSMKNFI保守肽段，距N端約290個氨基酸處存在GKVYTEPR保守肽段(以Bacillussp．TB-90尿酸酶的氨基酸序號為參考)。據(jù)已知N端序列設(shè)計簡并引物作為5端引物，針對兩處的保守序列設(shè)計簡并引物為3端引物，分別組合后優(yōu)化退火溫度進行PCR擴增，獲得了來自基因組DNA的多個片段；所得DNA片段經(jīng)T載體連接，轉(zhuǎn)化后藍白斑篩選，陽性克隆初步驗證插入序列后，測序得N端75

12、個氨基酸對應(yīng)基因片段；BLASTp搜索NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)其與Bacillussp．TB-90尿酸酶N端片段的相似性最高；同時，在用N端已知序列對應(yīng)簡并引物和針對下游保守序列簡并引物進行PCR克隆所得片段中，意外地發(fā)現(xiàn)了從距天然蛋白N端59個氨基酸殘基到翻譯終止密碼子下游的全序列；通過針對已知序列的全長克隆，確認了從第5位氨基酸到終止密碼之間的編碼區(qū)基因序列，翻譯后發(fā)現(xiàn)該尿酸酶總共含322個氨基酸殘基，分子量35．757kd；用BLAST

13、p搜索NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，其序列與Bacillussp．TB-90尿酸酶序列相似性最高(＞57％)，同Bacillussubtilissubsp．subtilisstr.l68尿酸酶序列相似性排第二，與BacillusclausiiKSM-K16尿酸酶序列相似性排第三，與BacillushaloduransC．125尿酸酶的序列相似性排第四；在此尿酸酶靠近N端70個氨基酸殘基附近存在上述細菌尿酸酶中保守序列ATDSMKNFI，而其他細菌

14、尿酸酶靠近下游(距離N端約290個氨基酸處)的另一保守序列，在該尿酸酶變?yōu)镚＃＃＃＃＃＃R，這可能是簡并引物PCR擴增未能直接得到從N端到此遠端保守序列對應(yīng)基因片段的原因。在用簡并引物PCR擴增時，還非特異地擴增出三個該菌株的其他蛋白基因片段，序列已提交GenBank(序列號為DQ464200～464202)。根據(jù)此酶的氨基酸序列，用InsightⅡ下的Homology模塊建立了其三維結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)70個氨基酸附近的保守序列和N端片斷位