苛求芽孢桿菌尿酸酶保守序列突變對(duì)其性質(zhì)的影響.pdf

1、苛求芽孢桿菌(ATCC29604)胞內(nèi)尿酸酶含322個(gè)殘基，四聚體為活性形式。此尿酸酶在pH7.4和37℃時(shí)半衰期約為23天，比真菌尿酸酶熱穩(wěn)定性高近10倍。分析晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，此尿酸酶N端前9位殘基和C端296到302位殘基以反向β-折疊方式聚攏成二聚體并維持亞基界面上的活性中心，其中N端有堿性和酸性的殘基而C端主要是酸性的殘基。本項(xiàng)目基于尿酸酶構(gòu)象分析、序列比對(duì)和定點(diǎn)突變，探索保守序列在酶熱穩(wěn)定性和活性中的作用，為其分子改造奠定基礎(chǔ)。

2、
　　1.苛求芽孢桿菌尿酸酶N端序列對(duì)其性質(zhì)的影響
　　野生型N端序列為AERTMFYGKGDV；據(jù)其晶體結(jié)構(gòu)，分析附近靜電作用網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)改變其靜電網(wǎng)絡(luò)的N端突變體。比較發(fā)現(xiàn)N端殘基突變后Ki、Km、最適溫度和最適pH變化較小，但比活性和熱穩(wěn)定性變化不同。野生型尿酸酶比活達(dá)約11.5kU/g，前三個(gè)氨基酸的突變ARR、QQR、RQR、VQR的比活分別為6.3kU/g、7.0kU/g、8.6kU/g、9.3kU/g，非變性PAG

3、E電泳發(fā)現(xiàn)均為四聚體，RER突變體比活提高到13.5kU/g。這些突變體在37℃時(shí)熱穩(wěn)定性與野生酶基本一致，4℃ pH9.2時(shí)穩(wěn)定性略有下降。但突變體 RESRESRER、REGREGRER、SSSSSRER比活性下降到4.3kU/g、2.7kU/g、4.8kU/g，經(jīng)非變性PAGE電泳發(fā)現(xiàn)仍為四聚體，且熱穩(wěn)定性在37℃ pH7.4變化顯著，分別為1.3d，0.75d，16d。最特別的是突變體Y7F，其比活能保留27％，但在37℃中性條

4、件熱失活加速1000倍。
　　2.苛求芽孢桿菌尿酸酶C端序列對(duì)其性質(zhì)的影響
　　對(duì)C端305位以后殘基突變或者截?cái)嗷蜓娱L(zhǎng)C端考察性質(zhì)改變。突變體D307R、去307都沒(méi)有活性，突變體去314、R310E、E311R、E318R、Y319F、L322R分別為3.2kU/g、4.4kU/g、3.6kU/g、3.3kU/g、2.9kU/g、3.6kU/g，均為四聚體；中性條件下37℃熱穩(wěn)定性明顯下降但堿性條件穩(wěn)定性變化小。突變體L

5、322SNSNSN、L322DSNSNSN、L322DSNSNSNHHHHHH表達(dá)之后經(jīng)DEAE-纖維素、制備型電泳純化后最高比活保留66%，且熱穩(wěn)定性基本不變。無(wú)論C端還是N端加入His標(biāo)簽后比活性都會(huì)下降，但熱穩(wěn)定性影響不大，用Ni2+-NTA純化效果與DEAE-纖維素接近，但效率高很多。
　　3.苛求芽孢桿菌尿酸酶中間保守區(qū)突變對(duì)其性質(zhì)的影響。
　　序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在此尿酸酶中間也有保守序列。其中A68L、T69V、D70

6、L、K73E、F179L、D185N、S243A、I244F、Q245I、H246E均無(wú)活性，非變性PAGE電泳觀察表達(dá)產(chǎn)物主要為二聚體；F179L為四聚體卻仍無(wú)活性。突變體D70N、S71A、T188V、T189V、E192Q、Y249F、F298L、Q299I、F301L的活性分別為0.55kU/g、0.34kU/g、0.65kU/g、0.53kU/g、1.85kU/g、4.71kU/g、1.97kU/g、0.93kU/g、2.59

7、kU/g；突變體D70N為二聚體，但有活性。在37℃和4℃及pH7.4和pH9.2時(shí)，這些突變體熱穩(wěn)定性均顯著下降，其中D70N、T188V、E192Q熱失活半衰期只為原來(lái)的0.1%。
　　4.苛求芽孢桿菌尿酸酶亞基之間離子鍵改變對(duì)其性質(zhì)的影響
　　在此尿酸酶四聚體晶體結(jié)構(gòu)中，每個(gè)二聚體中每個(gè)亞基的R140、E142、E291、R293與另一個(gè)二聚體中對(duì)應(yīng)相鄰亞基的E142、R140、R293和E291形成四對(duì)離子鍵；據(jù)此兩

8、個(gè)二聚體間形成八對(duì)離子鍵。突變體R140E、R140Q、E142R、E291Q、E291R中，E142為四聚體無(wú)活性，其余活性為1.3kU/g、1.6kU/g、13.3kU/g、0.1kU/g；E291Q活性較高但穩(wěn)定性最差。突變體N141C、P292C能形成二硫鍵，但不能提高穩(wěn)定性。這7個(gè)突變體與氧嗪酸鉀結(jié)合，在相應(yīng)條件下的熱穩(wěn)定性都可以顯著提高，最強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)達(dá)到數(shù)百倍。
　　5.苛求芽孢桿菌尿酸酶序列和性質(zhì)關(guān)系
　　此