18056.真菌β葡萄糖醛酸苷酶基因克隆及其非保守序列對酶學(xué)特性的影響

1、真菌β葡萄糖醛酸苷酶基因克隆及其非保守序列對酶學(xué)特性的影響Genecloningofβglucuronidasefromfungieffectofnonconservativesequenceontheenzymeproperties一級學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)科專業(yè)：生物化工作者姓名：劉艷麗指導(dǎo)教師：李春教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一二年六月摘要真菌P.purpurogenumLi3，A.terreusLi20和A.ustusLi62分別能

2、催化甘草酸生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸GAMG，GAMG與甘草次酸GA以及GA。本文克隆了來自A.terreusLi20和A.ustusLi62的3個β葡萄糖醛酸苷酶基因，并研究了A.terreusLi20的β葡萄糖醛酸苷酶非保守序列及其特性對酶學(xué)特性的影響，主要研究結(jié)果如下：克隆得到一個來自A.terreusLi20的β葡萄糖醛酸苷酶基因Atgus，全長1974bp，編碼657aa；克隆得到兩個來自A.ustusLi62的β葡萄糖醛酸苷

3、酶基因Augus1和Augus2，二者分別由1917bp和1827bp組成，編碼628aa和608aa。所克隆的β葡萄糖醛酸苷酶基因所編碼的蛋白質(zhì)同源性較高，AtGUS的C末端非保守序列最長（65aa），位于催化結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定面一側(cè)以及亞基結(jié)合位置，與PGUS（P.purpurogenumLi3的β葡萄糖醛酸苷酶）、AuGUS1和AuGUS2的非保守序列差異較大，預(yù)測其與酶蛋白催化特性相關(guān)。為了研究非保守序列對于AtGUS催化特性的影響，

4、擴增截除非保守序列的Atgus(3t)，研究二者在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達蛋白質(zhì)AtGUSE和AtGUS(3t)E酶學(xué)特性及蛋白構(gòu)象的差異。二者最適溫度均為55℃，最適pH分別為6.6和7.0，AtGUS(3t)E熱穩(wěn)定性提高；Co2，Ca2和Ni2對于二者酶活的激活抑制差異較大；AtGUS(3t)E（Km=1.95mM）對于底物甘草酸的親和力比AtGUSE（Km=12.9mM）高，且AtGUS(3t)E（KcatKm=7.16mM）的催

5、化效率是AtGUSE（KcatKm=2.24mM）的3.2倍；兩者二級結(jié)構(gòu)變化明顯。根據(jù)AtGUS的非保守區(qū)肽段的親疏水分析結(jié)果，確定兩個非保守序列截除位點，進行克隆，基因命名為Atgus(t1)（1~604aa）和Atgus(t2)（1~633aa），對其在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達蛋白質(zhì)AtGUS(t1)E和AtGUS(t2)E的酶學(xué)特性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行研究。二者最適溫度均為55℃，最適pH均為5.0；金屬離子對于AtGUS(t1)E和

6、AtGUS(t2)E具有相似激活抑制的作用；AtGUS(t1)E（Km=11.52mM）和AtGUS(t2)E（Km=10.46mM）與底物的親和力比AtGUSE高，AtGUS(t2)E（KcatKm=8.31mM?1s?1）催化效率顯著高于AtGUSE；AtGUS(t1)E和AtGUS(t2)E的二級結(jié)構(gòu)變化明顯，三級結(jié)構(gòu)變化不明顯。為研究極性氨基酸組成的非保守序列對于AtGUS的影響，克隆截除非保守序列的非極性氨基酸僅保留極性氨基酸

7、的基因Atgus(△NP)，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達蛋白質(zhì)AtGUS(△NP)E，研究非保守區(qū)極性氨基酸對于酶學(xué)特性以及蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：其最適溫度均為50℃，最適pH均為5.6；Mg2、Mn2、Co2、Ca2和Ni2對AtGUS(△NP)E具有激活作用；AtGUS(△NP)E對甘草酸反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km為4.85mM，催化效率（KcatKm）為1.90mM?1s?1；AtGUS(△NP)E的二級結(jié)構(gòu)與AtGUSE差異明顯，三級結(jié)構(gòu)變化不