極耐熱性β-葡萄糖醛酸酶基因的克隆及酶學(xué)性質(zhì).pdf

1、本研究以來(lái)源于海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)中的熱穩(wěn)定性β-葡萄糖醛酸酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，將其克隆至基因高效熱激表達(dá)載體pHsh中，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的表達(dá)，基因表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)一步熱處理后，酶純度達(dá)電泳均一。為其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。 本研究利用在線的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件，通過(guò)基因定點(diǎn)突變，優(yōu)化了mRNA的翻譯起始區(qū)，使核糖體結(jié)合位點(diǎn)從發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)中釋放出來(lái)，從而提高了表達(dá)量。通過(guò)對(duì)重組β-葡

2、萄糖醛酸酶在TB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)條件的研究，發(fā)現(xiàn)在OD600達(dá)到4左右時(shí)進(jìn)行熱激誘導(dǎo)，熱激誘導(dǎo)8h，效果最佳。 純化重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明，β-葡萄糖醛酸酶的最適反應(yīng)溫度為80℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，pH值5.8～8.2之間酶的穩(wěn)定性較好，80℃的半衰期為2h，SDS-PAGE分子量為65.9kDa，與理論推算值相吻合。以對(duì)硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷(pNPG)為底物時(shí)，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值0.18mmol/L，Vmax值為312U