黑曲霉EIM-6聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、聚半乳糖醛酸酶是果膠降解酶系中比較重要的一個(gè)組分,它在工業(yè),農(nóng)業(yè)等的多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的用途。本實(shí)驗(yàn)以一株產(chǎn)果膠酶的黑曲霉EIM-6菌株為出發(fā)菌株,克隆到黑曲霉聚半乳糖醛酸酶基因并成功實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母中的表達(dá),然后開(kāi)展了聚半乳糖醛酸酶增效研究。以提取的黑曲霉總基因組為模板,克隆聚半乳糖醛酸酶基因,Blast比對(duì)結(jié)果表明,聚半乳糖醛酸酶基因的保守性很高,基因內(nèi)部約200-250bp的位置為內(nèi)含子區(qū)域,成熟肽基因序列全長(zhǎng)為1113bp,可以翻譯

2、成370個(gè)氨基酸,分子量為38kD。進(jìn)一步對(duì)聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列、氨基酸組成、疏水作用、空間結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè),各個(gè)家族的聚半乳糖醛酸酶具有非常保守的作用位點(diǎn),而且它有明顯的信號(hào)肽可以實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。
   以克隆的聚半乳糖醛酸酶基因組基因?yàn)槟0?,設(shè)計(jì)引物,利用多引物重疊延伸PCR的方法克隆得到成熟肽基因。分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-pga和真核表達(dá)載體pPIC3.5K-pga,轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主大腸桿菌BL21和

3、巴斯德畢赤酵母GS115,誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示表達(dá)的重組聚半乳糖醛酸酶蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中以無(wú)活性的包涵體形式存在著,且難以實(shí)現(xiàn)酶的復(fù)性。在畢赤酵母GS115中的表達(dá)則成功的分泌出了分子量大小約為38kD且有活性的聚半乳糖醛酸酶蛋白,初步測(cè)定酶活為560個(gè)單位。經(jīng)分析其最適反應(yīng)溫度為50℃,最適pH為4.0,與野生的酶特性一致。
   利用獲得的聚半乳糖醛酸酶基因重組菌株,進(jìn)一步開(kāi)展聚半乳糖醛酸酶對(duì)整個(gè)果膠酶系其他組分的共發(fā)酵和增

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