冬棗果實(shí)中多聚半乳糖醛酸酶的純化及部分性質(zhì)分析.pdf

1、摘要果實(shí)成熟軟化過程中細(xì)胞壁水解酶活性升高，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)含物減少。經(jīng)研究，這些細(xì)胞壁酶中，‘多聚半乳糖醛酸酶(PG)是棗果實(shí)成熟軟化的關(guān)鍵酶。為了證明PG在這一作用中的機(jī)試‘本理、篩選PG的活性抑制劑、開展控制軟化轉(zhuǎn)基因工程的研究驗(yàn)以鮮食棗品種色查為材料，對PG進(jìn)行純化和部分性質(zhì)分析。首先，本研究就緩沖液類型、抽提時間、緩沖液中th濃度以及pH值等對PG抽提活性的影響進(jìn)行了探索。姑果表明，當(dāng)緩沖液中鹽濃度增加到1.Smo1“

2、L‘時，PG抽提活性仍很升高，說明高濃度的鹽有利于冬棗果實(shí)中PG的抽提。層析條件研究結(jié)果表明，倡樣品pH值低于、.5時，冬棗果實(shí)中PG不能有效吸附到CMSepharoseCL6B陽離子交換層析柱上，當(dāng)樣品pH值高于6.0時，PG能吸附到該層析柱上，且洗脫活性逐漸降低，pH值5.5時，吸附和洗脫效果均很好。另外，pH值梯度洗脫過程中，樣品活性損失較多而離子梯度洗脫蛋白分離效果好，同時回收率高，因此夕離子梯度洗脫適合于冬棗果實(shí)中PG的純化。

3、在SephadexG75凝膠過濾層析洗脫過程中，對樣品上樣量和洗脫流速進(jìn)行探索，結(jié)果使樣品與雜蛋白達(dá)到基線分類。經(jīng)過上述研究建立了冬棗果實(shí)中PG的純化程序J住要包括如下步驟:1.分步抽提PG蛋白。2.通過CMSepharoseCL6B陽離子交換柱。3.通過SephadexG75凝膠過濾層析柱。經(jīng)過上述步驟，純化了棗果實(shí)中多聚半乳糖醛酸酶，聚丙烯酞胺電泳檢測，呈現(xiàn)一條蛋白帶。性質(zhì)分析結(jié)果表明:冬棗果實(shí)中PG的最適pH值為4.7最適反應(yīng)溫度

4、為451C在不同溫度條件下，PG的穩(wěn)定性差異很大，40℃保溫1小時，其活性剩余79.6%60℃保溫1小時，其活性幾乎全部喪失。以多聚半乳糖醛酸為底物，370CpH值5.5條件下反應(yīng)，冬棗果實(shí)中PG的Km值為1.4mg“mlo)、關(guān)鍵詞:棗果實(shí)多聚半乳糖醛酸酶純化性質(zhì)分析冬棗果實(shí)中多聚半乳糖醛酸酶的純化及部分性質(zhì)分析1.前言果實(shí)軟化是果實(shí)后熟過程中最明顯的變化。果實(shí)的軟化主要是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變，包括初生壁的破壞及果膠物質(zhì)的降解。這些變化是

5、通過細(xì)胞壁酶的作用來實(shí)現(xiàn)的，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)，果膠甲醋酶(PME)、纖維素酶、0一半乳糖昔酶((3Gal)等，它們在細(xì)胞壁的降解過程中起著不同的作用。，文獻(xiàn)綜述1.1果實(shí)成熟軟化與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其成分的變化果實(shí)的細(xì)胞壁由初生壁、次生壁和相鄰兩個細(xì)胞初生壁之間的胞間層構(gòu)成。果實(shí)軟化過程中細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)都發(fā)生明顯的變化。對采后番茄果實(shí)的電鏡觀察表明，當(dāng)果實(shí)成熟衰老時，葉綠體數(shù)量減少，多數(shù)基粒結(jié)構(gòu)喪失，成熟果實(shí)細(xì)胞壁中膠層水解

6、成中空的電子透明區(qū)，初生壁的纖絲也發(fā)生一定程度的水解，相鄰細(xì)胞分離(141.菠蘿在貯藏過程中果肉細(xì)胞的細(xì)胞壁微纖絲層次性排列被破壞，中膠層電子密度降低，同時硬度下降I“).Philips“〕等發(fā)現(xiàn)，果實(shí)成熟時，胞質(zhì)呈不均一狀態(tài)，說明成熟是一種衰老現(xiàn)象，在此期間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的最大變化是中膠層開始溶解，初生壁破壞，同時，PG同工酶開始出現(xiàn)。稱猴桃果肉由硬變軟過程中，原果膠大量降解為可溶性果膠，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，胞壁纖維松馳，細(xì)胞壁逐步空泡化蕃荔枝

7、軟化過程中細(xì)胞膜透性增加(31:在研究棗軟化過程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，果肉薄壁細(xì)胞內(nèi)含物減少，乃至降解成絲狀，細(xì)胞壁中膠層降解，相鄰細(xì)胞分離1121在蘋果、梨軟化過程中也發(fā)現(xiàn)了類似變化[(27.391李在后熟期間，許多細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，內(nèi)層細(xì)胞壁加厚，最后果肉凝膠崩潰(991總之，果實(shí)在成熟過程中，細(xì)胞間隙的大小，細(xì)胞壁的構(gòu)造、厚度，果膠物質(zhì)的狀態(tài)，細(xì)胞膜及細(xì)胞結(jié)構(gòu)等都發(fā)生復(fù)雜的變化12011.1.2細(xì)胞壁酶的種類及其功能已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞