辣椒多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆及功能研究.pdf

1、病原菌與植物互作過程中，可分泌多種細(xì)胞壁降解酶，其中多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases，PGs）是主要的降解酶之一，主要是通過降解細(xì)胞壁的重要組分----果膠而破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致寄主產(chǎn)生壞死癥狀或加速病程發(fā)展，同時(shí)為病原菌的生長和繁殖提供糖源等營養(yǎng)物質(zhì)。多項(xiàng)研究表明PG是一種重要的致病因子。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase inhibiting protein，PGIP）是一種富含亮氨酸重復(fù)

2、（LRRs）的特異性細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，能專一地抑制內(nèi)切型PGs的活性，與PGs互作過程促進(jìn)了植物體內(nèi)產(chǎn)生與積累寡聚半乳糖醛酸（oligogalacturonide，Ogs），參與植物的抗病信號(hào)傳遞，增強(qiáng)了植物的抗病性，有效地阻斷病菌侵染和抑制相應(yīng)病程的發(fā)生與發(fā)展；同時(shí)PGIP與病原菌分泌的PGs結(jié)合，抑制了PGs的活性，減少了PGs對植物細(xì)胞壁的降解，有助于維護(hù)植物細(xì)胞壁的完整性，進(jìn)而減緩病原菌的定殖與繁殖，相應(yīng)的增強(qiáng)植物的抗病性，其抑制

3、PGs活性的能力與植物的抗病能力呈正相關(guān)。植物病害嚴(yán)重影響作物的質(zhì)量和產(chǎn)量，長期以來傳統(tǒng)的防治方法很難取得滿意的效果。鑒于PGs是一種重要的致病因子，且參與病原菌侵染植物的關(guān)鍵過程，而PGIPs又是一種特異抑制PGs活性的重要因子，多項(xiàng)研究表明，將PGIP基因?qū)胪椿虍愒粗参矬w中，其穩(wěn)定表達(dá)后將大大增強(qiáng)宿主植物的抗病性。因此可以通過PGIP在寄主體內(nèi)的過量表達(dá)來抑制病原菌分泌的PGs的活性，從而增強(qiáng)寄主的抗病性。本課題結(jié)合已有的研究基

4、礎(chǔ)，具體開展內(nèi)容如下：
　　 ⑴辣椒（Capsicum annuum L.）PGIP基因克隆及生物學(xué)分析。從辣椒中成功克隆到三個(gè)PGIP基因，命名為CaPGIP，均包含PGIP基因特有的富含亮氨酸重復(fù)（LRRs）結(jié)構(gòu)域，并且系統(tǒng)學(xué)分析界定了辣椒該類基因在進(jìn)化中的分類地位。
　　 ⑵三個(gè)CaPGIP基因mRNA的表達(dá)量差異分析。用多種脅迫因子處理4-6葉期辣椒葉片，熒光定量PCR檢測CaPGIP基因的相對表達(dá)量升高，外界的

5、刺激激活了植物體的防衛(wèi)反應(yīng)，PGIP參與了植物體內(nèi)抗逆信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 ⑶三個(gè)CaPGIP純蛋白對多種PGs活性的抑制效果分析。建立CaPGIP基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)，并通過親和層析純化出三個(gè)CaPGIP基因的純蛋白，采集分離到多種植物病原真菌和卵菌菌株，并用果膠誘導(dǎo)得到上述菌株的細(xì)胞壁降解酶（其中主要包括多聚半乳糖醛酸酶PGs），體外條件下，通過紫外分光光度法及瓊脂擴(kuò)散法檢測，三個(gè)CaPGIP純蛋白對PGs活性有不同程

6、度的抑制效果。
　　 ⑷辣椒體內(nèi)CaPGIP基因沉默后對其抗病性的影響分析。構(gòu)建CaPGIP基因的沉默表達(dá)載體pTRV2-CaPGIP1/2和pTRV2-CaPGIP3，通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）機(jī)理，將辣椒體內(nèi)的CaPGIP基因部分或整體進(jìn)行沉默，熒光定量PCR檢測到三個(gè)CaPGIP基因表達(dá)量明顯降低，將同一轉(zhuǎn)化植株接種強(qiáng)致病親和辣椒疫霉菌株SD33游動(dòng)孢子懸浮液，三到四天后觀察，發(fā)現(xiàn)處理組比對照組表現(xiàn)病斑擴(kuò)大癥狀。<

7、br>　　 ⑸轉(zhuǎn)CaPGIP基因煙草抗病性檢測。構(gòu)建了CaPGIP1基因的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體pROKⅡ-CaPGIP1，使外源基因在模式植物煙草體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)，通過組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因煙草的T0代，PCR檢測獲得陽性植株，然后接種煙草炭疽病菌和煙草赤星病菌，四天后觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株表現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的抗病性。
　　 ⑹PGIP對PGs活性的抑制具有廣譜性和特異性，且PGIP基因在寄主體內(nèi)的過量表達(dá)確實(shí)起到增強(qiáng)其抗病性的效