甜瓜多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因克隆及其反義序列植物表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、多數(shù)甜瓜(CucumismeloL.)果實(shí)的采后呼吸類型屬于躍變型，達(dá)到生理成熟的甜瓜果實(shí)采收后很快出現(xiàn)呼吸高峰，果肉迅速變軟，商品性和貯運(yùn)性大大降低。據(jù)統(tǒng)計(jì)，新疆哈密瓜在銷售地的短期貯藏?fù)p耗達(dá)5﹪～15﹪，甘肅黃河蜜甜瓜運(yùn)銷過程中的損耗率高達(dá)29.3﹪。實(shí)踐證明：選育出耐貯運(yùn)品種能夠減少貯運(yùn)過程中的損耗，是從根本上解決甜瓜貯運(yùn)難題的有效途徑之一。 果實(shí)的成熟軟化與一定數(shù)量的果膠被降解有關(guān)，這主要是多聚半乳糖醛酸酶(Polyga

2、lacturonase，PG)作用的結(jié)果。大量研究證明，甜瓜果實(shí)成熟過程中，PG1的mRNA含量最為豐富，能夠降解果實(shí)細(xì)胞壁中的果膠質(zhì)。應(yīng)用反義技術(shù)通過調(diào)控PG基因的表達(dá)進(jìn)而延遲果實(shí)的成熟軟化在番茄上已取得成功，顯示出良好的商業(yè)化前景。在甜瓜上，Kristen等已成功克隆甜瓜PG1基因cDNA全序列，這為研究利用反義PG1基因技術(shù)調(diào)控甜瓜果實(shí)的成熟提供了可能。 本研究是甜瓜保鮮延熟分子育種研究項(xiàng)目中的一部分。項(xiàng)目的總體研究目標(biāo)是

3、利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得貯運(yùn)性狀優(yōu)異的甜瓜新品種。本研究的目標(biāo)是運(yùn)用基因克隆技術(shù)獲得甜瓜的PG1基因全序列，構(gòu)建其反義序列植物表達(dá)載體，將該植物表達(dá)載體導(dǎo)入到模式植物煙草中，以檢驗(yàn)構(gòu)建的植物表達(dá)載體在植物中的正確表達(dá)，為甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。 通過實(shí)驗(yàn)研究獲得了如下結(jié)果：1.根據(jù)Kristen已發(fā)表的甜瓜PG1基因1182bp的cDNA全序列設(shè)計(jì)特異性引物，以從pCMPG/DH5a中提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物并

4、回收目的片段后，將其與pGEM-TEasyVector連接。對經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，序列分析結(jié)果表明與已知PG1基因核苷酸序列同源性高達(dá)99.33﹪。命名克隆載體為pGEM-PG。 2.用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切pGEM-PG和pBI121兩種質(zhì)粒DNA，分別回收PG1基因片段和除去了gus基因的pBI121線狀載體，將pBI121線狀載體去磷酸化處理后與PG1基因反向連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒。對

5、重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、SacⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，均能獲得1.2kb的目的片段。用EcoRⅤ酶切重組質(zhì)粒，電泳圖譜出現(xiàn)1205bp的預(yù)期條帶，證明目的基因片段已反向插入。以上結(jié)果表明，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI-aPG。 3.用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切植物表達(dá)載體pBI-aPG，切下3'端加有CaMV35S啟動(dòng)子和5'端加有NOS終止子的PG1反義基因單元35SP-aPG-NOST，隨后將其插入到pCAMBIA

6、2301質(zhì)粒載體上。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，可以獲得約1200bp的電泳條帶，再進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，可切下約3.2kb的預(yù)期片段。同時(shí)，對挑取的質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切，也切下了預(yù)期大小為1.2kb的片段。由此可知，成功構(gòu)建帶有g(shù)us報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pCA-aPG。 4.采用直接轉(zhuǎn)化法分別將插入有反義PG1cDNA的植物表達(dá)載體pBI-aPG和pCA-aPG導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。通過抗