基于核酸適配體的β-葡萄糖醛酸苷酶一步純化固定化研究及其應(yīng)用.pdf

1、隨著全球工業(yè)化進(jìn)程的快速發(fā)展，能源和環(huán)境危機(jī)已成為全人類共同面對的難題。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，這一問題尤為突出，尋找合理的解決之路已然迫在眉睫。而由生物催化主導(dǎo)的生產(chǎn)過程為此打開了一扇新的大門，生物催化法利用酶作為催化劑表現(xiàn)出良好的選擇性、專一性、高效性和綠色性，使用生物催化法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)催化法突顯出更大的應(yīng)用前景。但由于游離酶自身的一些缺陷限制了酶的工業(yè)化應(yīng)用，而固定化酶可以很好地解決這些弊端。傳統(tǒng)的酶固定化方法存在諸多缺點，為適應(yīng)生物

2、催化的規(guī)?；茝V及更好的滿足工業(yè)需求，迫切需要開發(fā)新型的酶固定化技術(shù)。
　　核酸適配體是一類能夠?qū)Π蟹肿赢a(chǎn)生特異性相互作用的核酸單鏈，被廣泛應(yīng)用于分子捕獲、生物成像、生物檢測、臨床診斷、藥物載送等領(lǐng)域。核酸適配體的高親和力和特異性使其在酶的固定化方面具有廣闊的開發(fā)潛力。本論文以開發(fā)新型酶固定化技術(shù)為目的，以甘草酸的生物催化轉(zhuǎn)化為應(yīng)用平臺，通過改進(jìn)的SELEX技術(shù)篩選β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）的核酸適配體，并將其共價連接在氧

3、化石墨烯和磁珠上，用于 PGUS-E的一步純化固定化，進(jìn)而生產(chǎn)高附加值甘草酸衍生物。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　?。?）β-葡萄糖醛酸苷酶核酸適配體的篩選及表征
　　通過鎳離子親和層析、離子交換、分子篩等方法對β-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行純化，并將其負(fù)載到 Ni-NTA磁珠上作為靶分子進(jìn)行 SELEX篩選。以包含40 nt隨機(jī)序列的 ssDNA作為初始文庫，通過孵育、分離、擴(kuò)增、制備 ssDNA完成一個篩選循環(huán)。同時為提高篩選特異

4、性，每三輪進(jìn)行一次反向篩選過程。調(diào)整磁珠用量、孵育時間、洗滌次數(shù)等參數(shù)提高篩選效率。鑒于催化反應(yīng)溫度的要求，將孵育溫度提高到40℃又進(jìn)行了6輪篩選。篩選結(jié)束后經(jīng)過克隆、測序總共得到16條 ssDNA序列。用表面等離子體共振技術(shù)測定其與 PGUS-E的親和力，結(jié)果表明篩選得到的 aptamer的解離常數(shù)在納摩爾級別，并且對 PGUS-E酶活沒有抑制作用。
　　（2）Aptamer與載體的共價連接及表征
　　選用比表面積極大、水

5、溶性極好的氧化石墨烯作為載體材料，通過化學(xué)改性提高其羧基官能團(tuán)富含量。將氨基修飾的 aptamer通過酰胺反應(yīng)共價連接到氧化石墨烯上，并用 UV-可見吸收光譜、熒光顯微鏡、FTIR等對其進(jìn)行表征；用同樣的方法將 aptamer共價連接的羧基功能化的二氧化硅磁珠上，并進(jìn)行相關(guān)表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改性的氧化石墨烯對 Apt5和 Apt9的負(fù)載量分別為29.08μg/mg和35.03μg/mg；羧基磁珠對 Apt5和 Apt9的負(fù)載量分別為10.

6、685μg/mg和13.565μg/mg。
　?。?）Aptamer與 PGUS-E之間的相互作用
　　考察了離子強(qiáng)度和 pH值對 aptamer與 PGUS-E之間相互作用的影響。以 NaCl濃度控制離子強(qiáng)度大小，發(fā)現(xiàn)當(dāng) NaCl濃度大于0.3 M時可以破壞 aptamer與PGUS-E之間的相互作用；NaCl濃度為1 M時可以實現(xiàn) aptamer連接的磁珠的再生。pH變化對二者相互作用的影響很小，敏感程度遠(yuǎn)不及離子強(qiáng)度。

7、pH為4和7時對二者相互作用有輕微影響。對 aptamer與 PGUS-E的吸附行為進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)可以用 Tenkin等溫吸附模型、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型、Elovich動力學(xué)模型和Webber-Morris內(nèi)擴(kuò)散動力學(xué)模型對這一過程進(jìn)行描述和預(yù)測。
　?。?）β-葡萄糖醛酸苷酶核酸適配體的應(yīng)用
　　將篩選得到的 aptamer用于β-葡萄糖醛酸苷酶的一步純化固定化，并將固定化酶用于甘草酸的催化轉(zhuǎn)化過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn) aptamer連

8、接的磁珠對 PGUS-E的最大負(fù)載量約為32μg/mg，經(jīng)過7個反應(yīng)批次后 Apt5和 Apt9固定化的 PGUS-E對甘草酸的轉(zhuǎn)化率分別為74.1％和56%，7個再生循環(huán)之后對甘草酸的轉(zhuǎn)化率分別是62.7%和58%；利用 aptamer自行構(gòu)建了可以用于現(xiàn) PGUS-E微量檢測的方法，該方法檢測限低，操作簡單，靈敏度高，檢測速度很快；構(gòu)建了利用 aptamer對 PGUS-E進(jìn)行分離純化的方法，與傳統(tǒng)的鎳離子親和層析相比得到的 PGU