芽孢桿菌漆酶基因隨機突變庫篩選與染料降解.pdf

1、漆酶作為一種重要催化劑，廣泛應用于食品、制漿造紙及紙漿生物漂白等領域，但是漆酶在高pH及高溫條件下容易失活，限制了其應用。本文以獲得耐高pH或耐高溫漆酶突變漆酶為目標，對Error-prone PCR構建成功的Bacillus subtilis LS03 CotA漆酶基因隨機突變庫進行高通量篩選，并對突變漆酶的酶學性質和常見染料降解能力進行系統(tǒng)分析比較。
　　利用96孔板初篩和大量定性復篩，最終獲得5株酶活較高的突變菌株:O19、

2、K14、K9、W3、W8，其中突變菌株O19粗酶活性比野生型提高了5.65倍;通過對突變漆酶同源建模獲得三維結構表明5個突變漆酶相應的氨基酸突變位點大部分位于酶分子第三結構域的表面，其中只有突變漆酶O19的第260位氨基酸突變位于“口袋”結構內部表面。
　　突變漆酶O19和野生型漆酶CK經(jīng)His Trap HP分離純化，測得O19純酶的比酶活是CK的1.78倍， O19的異源表達量也明顯高于CK;同時對底物ABTS和SGZ的催化效

3、率及親和力都有顯著提高;突變型漆酶O19在pH耐受性和對金屬離子的影響方面有明顯的提升，其中K+、Mn2+、Co2+對O19的促進作用提升了20％多;突變漆酶對部分抑制劑和表面活性劑抗性高于野生型漆酶，但是不具有高溫耐受性。
　　在降解4種常見的染料方面，O19降解活性亮藍和剛果紅的能力上均高于CK，降解率平均提高10％左右。研究了突變型漆酶降解靛藍過程中染料濃度、介體濃度、漆酶濃度三個因素對其降解的影響，正交試驗得到三個因素中介