側(cè)孢短芽孢桿菌侵染性蛋白酶的表達及其隨機突變文庫的構(gòu)建.pdf

1、植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)良好發(fā)展的重要因素。生物防治線蟲具有對環(huán)境和人類危害小并且不會產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)勢，已成為線蟲防治的研究熱點。然而以天然活菌劑為基礎(chǔ)的生物殺線劑毒力小、穩(wěn)定性差對溫度敏感造成實際生防效果緩慢效率低下。因此，研究食線蟲微生物侵染線蟲的毒力因子及其作用的分子機制對提高生物殺線劑的穩(wěn)定性和毒力，促進生物殺線劑的實際生防效率具有重要的意義。側(cè)孢短芽孢桿菌G4產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶BLG4是強殺線蟲的主

2、要毒力因子，是研究絲氨酸蛋白酶侵染線蟲機制的理想材料。本論文通過蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)研究絲氨酸蛋白酶降解線蟲體壁并殺死線蟲的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機理。 通過對16S rRNA基因序列的分析，從分子水平上確認出發(fā)菌就是具有高效殺線蟲毒力的Brevibacillus laterosporus G4菌株；利用單因素試驗結(jié)合Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化B.laterosporus G4的發(fā)酵培養(yǎng)體系，獲得的培養(yǎng)體系搖瓶發(fā)

3、酵30小時蛋白酶活力可達12379 U/ml，比優(yōu)化前提高了5倍。 采用單因素設(shè)計試驗對芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系進行優(yōu)化，獲得的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)電轉(zhuǎn)效率可達6.0×104 cfu/μgDNA，存活率達到3.O％；分別利用枯草芽孢桿菌整合型表達載體pSG1729B和自主獨立復(fù)制型表達載體pHY3000PLK構(gòu)建蛋白酶BLG4的異源重組表達質(zhì)粒，并成功實現(xiàn)在B. sublilis WB600中的穩(wěn)定高效和高通量表達。 運用易錯PCR技術(shù)擴增

4、蛋白酶BLG4的成熟肽片段，然后采用重疊延伸PCR技術(shù)獲得具有完整編碼區(qū)的突變基因，連接到pMD-T18 Simple Vector構(gòu)建庫容約為5.1×104 cfu、突變率為0.536％的高質(zhì)量蛋白酶BLG4的隨機突變文庫。應(yīng)用B。subtilis WB600表達體系構(gòu)建蛋白酶BLG4的隨機突變表達文庫，高通量篩選獲得熱穩(wěn)定性得到較大改善的突變體Mut-01。通過對突變體Mut-01的氨基酸序列和模擬的空間結(jié)構(gòu)分析表明，207位的Cy