白腐真菌漆酶基因異源表達與污染物降解研究.pdf

1、漆酶因其底物廣泛性，能夠有效降解木質(zhì)素及多種有機污染物。白腐真菌具有豐富的漆酶基因資源，故本研究以能夠高效降解木質(zhì)素功能的白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC162為出發(fā)菌株，在明確其胞外粗酶液對不同結(jié)構(gòu)染料的降解的基礎上，以漆酶基因獲取、表達及污染物降解為主要研究內(nèi)容。進行了漆酶基因的克隆、異源表達、分離純化、理化性質(zhì)及其對硝基苯酚類（NPs）、氯酚類（CPs）和磺胺類（SAs）有機污染物的降解及其途徑研究及其降

2、解研究。主要研究結(jié)論如下：
　　白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC162胞外粗酶液能夠有效降解單偶氮類，三氯甲烷類和蒽醌類的部分染料。其中，MO(100mg/L)，CV(100mg/L)，MG(100mg/L)，BB(100mg/L)，RB4(800mg/L)和RBBR(800mg/L)在28℃，24h后的降解率依次為81.3％、87.6%、85.1%、98.0%、64.6%和89.1%。在降解體系中添加了

3、一定濃度的漆酶特異性抑制劑（曲酸）之后，降解效果顯著下降。各合成染料在相同條件下，降解率分別降至0.1%、12.9%、11.9%、18.9%、9.3%和5.1%。表明漆酶是胞外粗酶液降解染料的重要因素。
　　對來源于白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC162的三個漆酶基因（lacc6，lacc9和lacc10）在畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達。并通過發(fā)酵培養(yǎng)和分離純化分別獲得了三個具有漆酶活性的重組漆酶（rLACC

4、6，rLACC9和rLACC10），其表觀相對分子質(zhì)量分別為64、75和64kDa。通過分離純化之后得到的重組漆酶比酶活分別為45.50、9.36和8.56U/mg。最適反應pH分別為2.5、3.5和4.0。最適反應溫度分別為60、40和40℃。對低溫和偏堿性的耐受性更好。DDT和疊氮鈉對三個重組漆酶的抑制效果最明顯。rLACC6對金屬離子和有機試劑的適應性及耐受性優(yōu)于rLACC9和rLACC10。三個重組漆酶對Cu2+，K+和Na+的

5、適應性優(yōu)于其他金屬離子。對丙酮，乙醇和乙腈的耐受性優(yōu)于其他有機試劑。
　　進一步研究了重組漆酶（rLACC6，rLACC9和rLACC10）以丁香酸作為介體，在漆酶-介體（LMS）下對不同類型的有機污染物的降解情況。三個重組漆酶對2-硝基苯酚（2-NP）、3-硝基苯酚（3-NP）、4-硝基苯酚（4-NP）、2-氯酚（2-CP）、3-氯酚（3-CP）、4-氯酚（4-CP）、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,6-二氯酚（2,6-D

6、CP）、磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲嘧啶（SMZ）和磺胺甲惡唑（SMX）在60min后的最高降解率分別為59.21%、47.91%、60.24%、41.35%、32.68%、36.72%、37.82%、35.05%、98.1%、97.5%和97.8%。降解過程均符合一級動力學方程。通過LC-MS和GC-MS檢測了降解不同類型的有機污染物的過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，并推測了rLACC6對4-NP，2,4-DCP和SDZ的可能的降解途徑。其中3