豬miR-378種子序列突變對其功能的影響.pdf

1、本實驗使用基因克隆、Q-PCR和雙熒光素酶報告系統(tǒng)等實驗技術和方法對miR-378的種子序列突變以及突變后對miR-378功能的影響進行了相關研究，獲得了以下結果:
　　1、利用連聚合酶反應(PCR)技術擴增榮昌豬、內(nèi)江豬，長白豬以及杜洛克的miR-378-2基因的DNA片段，將此片段進行測序，分析發(fā)現(xiàn):榮昌豬和內(nèi)江豬的miR-378-2基因中存在一個堿基A/G突變，長白豬和杜洛克豬中并沒有發(fā)現(xiàn)此突變。此突變位于miR-378-2

2、成熟體的種子序列，且突變能夠改變pre-miR-378的二級結構及自由能。
　　2、利用Q-PCR技術以及攜帶該突變個體的miRNA高通量測序數(shù)據(jù)對miR-378表達量進行分析發(fā)現(xiàn)，成熟體miR-378（野生型和突變型）主要分布于心肌、骨骼肌以及皮下脂肪等組織中，說明，miR-378分布具有組織特異性。
　　3、通過構建野生型和突變型miR-378串聯(lián)表達載體，在3T3-L1細胞中進行體外過表達。發(fā)現(xiàn)，miR-378突變后的

3、表達量極顯著高于突變前的表達量，說明，miR-378-2種子序列中A/G突變極顯著增加了miR-378-2的表達量。
　　4、基于種子序列與3' UTR區(qū)的序列匹配關系，以人的基因組為參考，對野生型miR-378和突變型miR-378的靶基因進行預測，結果顯示，該突變完全改變了miR-378對靶基因的識別，突變型miR-378的靶基因的數(shù)量高于野生型miR-378的靶基因數(shù)量;對兩種軟件預測共有的靶基因進行交集和GO分析，結果顯示

4、，野生型和突變型miR-378具有完全不同的兩種功能趨勢，野生型miR-378功能主要與RNA相關的生命過程相關，部分與脂肪沉積相關;突變型miR-378功能主要與蛋白的降解有關，無與脂肪沉積相關的靶基因。
　　5、隨機挑選部分靶基因，利用雙熒光素酶報告基因實驗驗證突變miR-378對抑制靶基因表達功能的結果表明，miR-378突變后出現(xiàn)失去對部分靶基因的識別能力（Loss-of-function）和獲得一些新的靶基因（Gain-