187Q突變對人sTALL-2分子功能的影響.pdf

1、TALL-2(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 2，TNF和凋亡配體相關(guān)的白細(xì)胞表達(dá)配體2)，又名APRIL(a proliferation inducing ligand，增殖誘導(dǎo)配體)，是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員之一。屬Ⅱ型跨膜蛋白，N端在胞內(nèi)，C端在胞外，有膜結(jié)合型和可溶性兩種活性形式。TALL-2在正常組織中幾乎檢測不到，但是在多種

2、類型的惡性腫瘤細(xì)胞中卻有高水平表達(dá)，并且可以在體內(nèi)、體外促進(jìn)這些惡性腫瘤細(xì)胞的生長。鑒于TALL-2與腫瘤細(xì)胞之間的密切關(guān)系，設(shè)法有效抑制TALL-2的功能活性，將可能為相關(guān)腫瘤的治療提供嶄新途徑。研究表明TALL-2抗體和TALL-2的可溶性受體能夠在一定程度上抑制TALL-2的功能，但是這兩種策略都不涉及TALL-2分子本身的改變，因此我們想另辟蹊徑，通過改造TALL-2分子構(gòu)建能夠與受體結(jié)合但是不能引發(fā)受體后效應(yīng)的TALL-2突變

3、體的方法，得到TALL-2的有效抑制劑。 在本課題組已成功克隆并表達(dá)了重組人可溶性TALL-2(soluble TALL-2，sTALL-2，編碼105-250氨基酸序列)分子的基礎(chǔ)上，借鑒Liu等人改建TALL-1(TNF and apoptosisligand-related leukocyte-expressed ligand 1，又稱BLyS或BAFF)分子的方法，在與TALL-1同源序列比對以及對TALL-2分子結(jié)構(gòu)分

4、析后，選擇TALL-2第187位作為突變位點(diǎn)，借助一步反向PCR致突變法構(gòu)建人sTALL-2第187Q的三個突變體，進(jìn)而對sTALL-2突變體蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化及生物學(xué)活性檢測。 取得的主要結(jié)果如下： 1．以pUC18/sTALL-2為模板，經(jīng)一步反向PCR法構(gòu)建了以編碼絲氨酸的TCT、編碼天冬氨酸的GAT和編碼精氨酸的CGT替換sTALL-2第187位編碼谷氨酰胺的CAA的三個突變體，分別命名為pUC18/msTALL

5、-2-S、pUC18/msTALL-2-D和pUC18/msTALL-2-R。 2．將上述測序正確的突變型目的片段分別連接于原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L，構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/msTALL-2-S、pQE-80L/msTALL-2-D和pQE-80L/msTALL-2-R。 3．將上述重組原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均獲得了較高水平的表達(dá)，并確立sTALL-2第187Q突變體msT

6、ALL-2-S、msTALL-2-D和msTALL-2-R在大腸桿菌中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件均為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。SDS-PAGE分析可見，各重組蛋白的大小均約為19kDa，主要是以包涵體的形式存在。Westem blotting分析顯示，各目的蛋白均在分子量約19kDa處出現(xiàn)單一條帶。 4．經(jīng)Ni<'2+>-NJlA純化系統(tǒng)及尿素透析，各重組蛋白得到了有效純化和復(fù)性。純化蛋白在SDS-PA

7、GE上呈現(xiàn)單一條帶。經(jīng)Sephadex G-75柱層析后得到各重組突變體的同源三聚體分子。 5．生物學(xué)活性分析顯示，所制備的msllALL-2-S、msTALL-2-D和msTALL-2-R三種突變體蛋白均能與A549肺癌細(xì)胞及HepG2肝癌細(xì)胞上的受體結(jié)合，并且可以不同程度地阻斷sTALL-2功能，抑制其對腫瘤細(xì)胞的增殖作用。 重組人可溶性TALL-2突變體的制備及功能研究，為研制新型TALL-2抑制分子創(chuàng)造了條件，同