RNA序列、位置及短序列增強子突變影響報告基因表達.pdf

1、目的:在人和哺乳動物基因組中存在大量非編碼DNA序列（non-coding DNA，ncDNA），其功能絕大部分還不清楚。研究非編碼序列對基因表達調(diào)節(jié)的機制，進而探尋非編碼序列新的生物學(xué)功能，對于認識人和哺乳動物的生物學(xué)行為，包括分化和衰老，有重要價值。
　　由ncDNA轉(zhuǎn)錄得到的非蛋白編碼RNA(non-protein coding RNA，ncRNA)數(shù)量巨大，有研究顯示RNA具有活化基因的作用;本研究室以前的研究也發(fā)現(xiàn)外源R

2、NA可促進小鼠白蛋白基因表達并增加該基因?qū)NaseⅠ消化的敏感性，另外生物信息學(xué)分析同樣也證實了RNA可以活化基因。雖然已發(fā)現(xiàn)某些ncRNA序列具有活化基因和其它生物學(xué)效應(yīng)，但大多數(shù)ncRNA序列的功能是未知的。在本項研究中，用能夠產(chǎn)生RNA的誘導(dǎo)質(zhì)粒（來自pcDNA3.1載體）和攜帶GFP基因的報告質(zhì)粒（來自pEGFP-C1載體）轉(zhuǎn)染HeLa細胞，研究RNA可能作為一種反式調(diào)節(jié)因子對GFP報告基因表達的影響。觀察RNA的長度、序列和

3、產(chǎn)生位置是否對GFP報告基因表達有不同的影響。在三個層次檢測RNA產(chǎn)生位置對GFP報告基因表達的影響，這三個層次分別是在GFP基因下游插入序列，插入序列與GFP基因受同一啟動子驅(qū)動（相當(dāng)于與GFP屬于同一基因）;在質(zhì)粒的插入序列下游再插入CMV啟動子，再于CMV啟動子的下游插入不同序列（插入序列與GFP基因受不同的啟動子驅(qū)動，相當(dāng)于順式鄰近基因的影響）;第三個層次觀察共轉(zhuǎn)染的誘導(dǎo)質(zhì)粒上的插入序列產(chǎn)生的RNA對報告質(zhì)粒的GFP基因表達的影

4、響（相當(dāng)于位于不同染色體的基因產(chǎn)生的RNA的影響）。用生物信息學(xué)方法比較正在分化的淋巴細胞與靜止的淋巴細胞，觀察這些細胞中高表達基因內(nèi)含子大小是否有差異，從而提示內(nèi)含子RNA是否影響基因表達。
　　增強子是活化基因的順式元件，在基因表達調(diào)節(jié)中起重要作用。增強子突變會導(dǎo)致其功能發(fā)生改變。本研究室的前期工作發(fā)現(xiàn):將14個Alu同向串聯(lián)（Alu×14）后插入到pEGFP-C1質(zhì)粒的GFP基因下游，構(gòu)建C1-Alu×14質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染He

5、La細胞，Alu×14序列顯著抑制GFP基因表達;再將SV40PolyA正、反序列插入到C1-Alu×14質(zhì)粒的GFP和Alu×14之間，結(jié)果顯示SV40PolyA序列能解除Alu×14對GFP基因的抑制作用。通過刪減SV40PolyA得到一段長22bp的片段（簡稱22R，5'-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT，結(jié)構(gòu)見第二部分Fig.1），發(fā)現(xiàn)22R能活化基因，對22R進行點突變后獲得4TMI(5'-GTGAAATAAATG

6、CTTTTTTTGT)，發(fā)現(xiàn)4TMI有更強的活化基因作用。22R和4TMI均有對稱結(jié)構(gòu)，可能形成不穩(wěn)定莖環(huán)（unstable stem-loopstructure），而22R的另一突變體4T(5'-GTGAAAAAAATGCTTTTTTTGT)不活化基因，其序列可形成穩(wěn)定的莖環(huán)，因此推測增強子活化基因能力與序列形成不穩(wěn)定莖環(huán)或一定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　為了進一步探討22R活化基因的機理，本研究對22R序列3核苷酸環(huán)(loop)的堿基進

7、行了突變，包括野生型共128個（其中正序插入64個，反序64個），選擇C1-Alu×14作為表達載體構(gòu)建的基礎(chǔ)，在Alu重復(fù)序列上游插入短序列增強子構(gòu)建表達載體;然后轉(zhuǎn)染HeLa細胞，通過熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)、Northern雜交檢測GFP表達情況，觀察分析這128種序列對GFP報告基因表達的影響。所得實驗結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)分析，探討3堿基loop中堿基類型對基因表達影響的規(guī)律，對闡明DNA結(jié)構(gòu)在基因表達調(diào)節(jié)中的作用有重要意義。不穩(wěn)定

8、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因表達可能是非編碼序列的新功能。
　　方法:1引物及模板DNA片段的合成。委托DNA合成公司合成帶適當(dāng)酶切位點的引物和帶有不同突變位點的DNA模板。論文附表中列出了所使用的引物及模板序列及其名稱。
　　2重組報告質(zhì)粒和誘導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴增目的片段，目的片段包括質(zhì)粒中的DNA序列和合成的DNA片段,酶切后插入pEGFP-C1質(zhì)粒，獲得插有一個片段報告質(zhì)粒，利用XbaⅠ/NheⅠ酶切位點可以用T4DNA連接酶

9、連接，但是連接以后的序列不能被其中的任何一個酶切斷的特性制備同向二串聯(lián)體，或多個拷貝的插入序列串聯(lián)體的質(zhì)粒。HindⅢ/KpnⅠ酶切pcDNA3.1，瓊脂糖電泳膠分離大片段，帶有串聯(lián)體的報告質(zhì)粒用HindⅢ/KpnⅠ酶切，膠分離插入串聯(lián)體中的小片段，連接大小片段，獲得正向插入串聯(lián)體的誘導(dǎo)質(zhì)粒;KpnⅠ/XbaⅠ酶切pcDNA3.1，瓊脂糖電泳膠分離大片段，帶有串聯(lián)體的報告質(zhì)粒用KpnⅠ/XbaⅠ酶切，膠分離插入串聯(lián)體中的小片段，連接大小

10、片段，獲得反向插入串聯(lián)體的誘導(dǎo)質(zhì)粒。
　　3細胞轉(zhuǎn)染用LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，包括報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和報告質(zhì)粒與誘導(dǎo)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染兩種轉(zhuǎn)染方法，詳見論文正文。
　　4熒光顯微鏡觀察將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞后熒光顯微鏡下計數(shù)GFP熒光陽性細胞數(shù)。
　　5 Northern雜交用9N隨機引物和大腸桿菌DNA聚合酶大片段，將α-32p-dCTP摻入DNA中制備GFP探針。提取轉(zhuǎn)染細胞總RNA，甲醛

11、變性瓊脂糖凝膠電泳，將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。32p標(biāo)記的GFP探針雜交、沖洗后通過放射自顯影記錄實驗結(jié)果。然后，這種雜交過的尼龍膜用剝離液處理，去除32p-GFP探針，用檢測neo RNA的探針再次雜交，放射自顯影作為轉(zhuǎn)染效率的對照。
　　6流式細胞分析委托河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院完成。
　　7 PAGE電泳區(qū)別DNA寡核苷酸構(gòu)象
　　合成的不同DNA單鏈小片段（22nt，帶有單堿基突變）用20％的變性膠在室溫進行PAGE，

12、銀染，觀察不同DNA小片段泳動速度，然后用非變性膠電泳（改變溫度和離子強度），觀察DNA小片段電泳速度，推測它們是否形成了不同的空間構(gòu)象。
　　8生物信息學(xué)分析從UniGene庫獲得基因表達數(shù)據(jù)。從UniGene庫獲得基因表達數(shù)據(jù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/lbrowse2.cgi?TAXID=9606&CUTOFF=1000）。選擇高表達的基因，從人類基因組資源庫(http://ww

13、w.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)獲得內(nèi)含子和外顯子數(shù)據(jù)，使用微軟Excel軟件對內(nèi)含子的長度和數(shù)量進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1重組誘導(dǎo)質(zhì)粒及報告質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定
　　所有構(gòu)建成功用于實驗的質(zhì)粒，均通過酶切和測序鑒定正確。
　　2 RNA以長度和序列依賴的方式影響基因表達
　　誘導(dǎo)質(zhì)粒與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)質(zhì)粒以長度和序列依賴方式影響基因表達，例如誘導(dǎo)質(zhì)

14、粒pcAlu×14能引起報告質(zhì)粒C1-Alu×8中的GFP的表達，但是誘導(dǎo)質(zhì)粒pc280-1×14不能引起報告質(zhì)粒C1-Alu×8中的GFP的表達，說明誘導(dǎo)質(zhì)粒的插入序列不同對報告質(zhì)粒的GFP基因影響不同。RNA活化GFP報告基因也具有長度依賴性，例如pcAlu×14誘導(dǎo)質(zhì)粒引起的報告質(zhì)粒的GFP基因的陽性細胞率顯著高于pcAlu×1(p＜0.05)。以上結(jié)果說明:誘導(dǎo)質(zhì)粒產(chǎn)生RNA以序列和長度依賴的方式影響基因的表達。
　　3

15、RNA以位置依賴的方式活化基因
　　為了進一步研究RNA產(chǎn)生的位置（與GFP同一基因及順式臨近基因）對GFP報告基因表達的影響，把目的基因分別插入到GFP基因下游及鄰近部位，研究基因的重復(fù)序列是否可以激活GFP基因的表達。
　　質(zhì)粒C1-Alu×1-Alu×14比質(zhì)粒C1-280-1×1-280-1×14有更強的基因抑制作用;在具有增強子4TMI時，Alu序列（C1-Alu×1-4TMI×2-Alu×14）誘導(dǎo)GFP基因表達

16、比280-1（C1-280-1×1-4TMI×2-280-1×14）更強;分析下游序列對GFP基因表達的的影響與產(chǎn)生的RNAs（從基因本身產(chǎn)生的RNA影響其自身表達）有關(guān)。
　　在C1-280-1×14載體中280-1×14的下游插入CMV，然后在CMV啟動子的下游插入不同的序列，構(gòu)建質(zhì)粒（相當(dāng)于改變GFP基因相鄰基因的序列）。結(jié)果表明，質(zhì)粒C1-280-1×14-CMV-280-1×2中CMV下游插入的2個280-1正和Alu-

17、280-1正比其他序列有活化GFP報告基因作用。插入含有兩個相同序列的誘導(dǎo)質(zhì)粒對C1-280-1×14中的GFP基因表達沒有顯著影響（數(shù)據(jù)見論文第一部分）。
　　同一基因和臨近基因序列對GFP報告基因產(chǎn)生明顯影響，但是誘導(dǎo)質(zhì)粒中的同樣序列產(chǎn)生影響較弱。這些結(jié)果說明，RNA產(chǎn)生的位置是影響報告基因表達的因素。
　　當(dāng)這些重復(fù)序列分別插入pcDNA3.1載體中構(gòu)造誘導(dǎo)質(zhì)粒與相應(yīng)報告質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染時，他們沒有激活報告基因，這些結(jié)果

18、表明,RNA序列和RNA產(chǎn)生位置是影響基因表達的重要因素。
　　4在分化細胞中大基因高表達通過生物信息學(xué)分析比較胸腺細胞和T細胞，生發(fā)中心B細胞和B細胞中高表達基因中大基因(≥60000bp)的數(shù)量，比較高表達基因中內(nèi)含子的大小，發(fā)現(xiàn)在未分化細胞中大基因數(shù)量多，平均每個內(nèi)含子的堿基多。
　　522R序列l(wèi)oop3堿基突變體（正序）對GFP報告基因表達的影響
　　22R序列（5'-GTGAAAAAAATGCTTTATTT

19、GT）及其loop3堿基的突變體（正序）分別插入到C1-Alu×14載體的Alu序列上游，構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)染HeLa細胞。流式細胞儀檢測結(jié)果和熒光顯微鏡分析及Northern Blot均表明，loop環(huán)3堿基突變可明顯影響增強子的活性。例如:GTG質(zhì)粒（5'-GTGAAAAAAAGTGTTTATTTGT）熒光陽性率為3.77％，AAA質(zhì)粒（5'-GTGAAAAAAAAAATTTATTTGT）熒光陽性率為0.24％。
　　622R序

20、列l(wèi)oop3堿基突變體反序列對GFP報告基因表達的影響
　　將兩拷貝的22R序列l(wèi)oop3堿基突變體反序構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，用流式細胞儀檢測GFP陽性細胞，22R突變體反序大部分的熒光陽性百分數(shù)和平均熒光強度高于其正序，如:CTG正序百分數(shù)為43.23，平均熒光強度為6.5，反序百分數(shù)為65.06，平均熒光強度為25.2熒光強度平均數(shù)的比值（反序/正序）為3.88; AGG正序百分數(shù)為52.85，平均熒光強度為11.9

21、，反序百分數(shù)為60.75，平均熒光強度為25.4，熒光強度平均數(shù)的比值（反序/正序）為2.84;僅有一個例外，AGC正序百分數(shù)為67.17，平均熒光強度為18.8，反序百分數(shù)為60.75，平均熒光強度為25.4，熒光強度平均數(shù)的比值（反序/正序）為1.35，說明突變體的反序活化基因作用強于其正序。
　　7 PAGE電泳區(qū)別DNA寡核苷酸構(gòu)象用20％的變性膠在室溫進行PAGE，發(fā)現(xiàn)所有的寡核苷酸的電泳遷移率基本相同。而在低溫和增大離

22、子強度時富含T堿基的序列遷移率受影響較小，所以用富含T的序列作為分子量對照，在室溫，1×TBE緩沖液中電泳，TAA、TAT、TAC、TAG和CTA序列的泳動速度最快，而其他序列的遷移率相當(dāng)。在更低溫度(4℃)下1×TBE緩沖液中進行電泳，雖然不同序列的遷移率有更大的差別，但是TAA、TAT、TAC、TAG和CTA序列的泳動速度還是最快的。這些結(jié)果說明loop位堿基影響序列的次級結(jié)構(gòu),可能涉及到增強子活性。
　　結(jié)論:
　　1

23、 RNA以長度和序列依賴的方式特異性影響基因表達，誘導(dǎo)質(zhì)粒的插入序列和長度不同對報告質(zhì)粒的GFP基因影響不同。
　　2 RNA產(chǎn)生位置顯著影響基因表達，同一基因和臨近基因序列對GFP報告基因產(chǎn)生明顯影響，但是誘導(dǎo)質(zhì)粒中的同樣序列產(chǎn)生影響較弱。
　　322R Loop的堿基類型影響序列的次級結(jié)構(gòu)，顯著影響增強子活性。
　　422R突變體正反序?qū)FP基因表達的影響不同，反序大部分的熒光陽性百分數(shù)和平均熒光強度高于其正序。