增強子位點突變對GFP報告基因表達影響及生物信息學分析.pdf

1、目的：增強子(enhancer)是上調(diào)基因表達的順式(cis)元件，其上調(diào)基因表達的機理尚有許多值得研究之處。本研究室前期工作證明，SV40PolyA序列中一段長22bp的片段(稱為22R，5’-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT)能活化GFP報告基因，22R的變異體有的可以活化GFP報告基因有的不能活化GFP報告基因，如4TMI(5’-GTGAAATAAATGCTTTTTTTGT)可以活化GFP報告基因，22R4C(5’-G

2、TGAAAAAAATGCTTTCTTTGT)不活化GFP報告基因。
　　為什么類似的序列活化基因作用不同，為弄清堿基片段和單個堿基在活化基因中的作用，我們對22R序列進行突變，發(fā)現(xiàn)AA(5’-GTGAAATAAATGCAAATAAAGT)可以活化GFP報告基因，而7pieA(5’-GTGAAAAAAATGCAAAAAAAGT)不能活化GFP報告基因，顯然AA中的第7位T和第17位T對于活化GFP報告基因有作用，那么AA中的其他T堿

3、基是否也參與活化基因過程呢?于是又對AA序列中的第2、第11和第22位“T”進行突變，研究這幾個位點T堿基突變對GFP報告基因表達的影響。
　　方法：
　　1、引物和作為模板的DNA片段設計帶有適當酶切位點的引物和DNA片段模板，委托DNA合成公司合成。表1列出本文中合成的引物和作為模板的DNA片段。
　　2、重組質(zhì)粒構(gòu)建以人工合成的帶有突變位點的序列為模板，用帶有適當酶切位點的引物擴增目的片段，酶切后插入pEGFP-

4、C1質(zhì)粒，獲得插入1個目的片段的重組質(zhì)粒(×1重組質(zhì)粒)，用HindⅢ/XbaⅠ酶切×1重組質(zhì)粒，膠回收大片段，用HindⅢ/NheⅠ酶切×1重組質(zhì)粒，膠回收小片段，用T4DNA連接酶連接大、小片段，得到同向二串連體插入質(zhì)粒(×2重組質(zhì)粒)。將×2重組質(zhì)粒用HindⅢ/NheⅠ酶切，膠回收小片段，連入經(jīng)HindⅢ/XbaⅠ酶切的Cl-Alu14質(zhì)粒(pEGFP-C1質(zhì)粒的GFP基因下游同向、正向插入14個Alu)的GFP和串聯(lián)Alu序列

5、之間。
　　3、細胞轉(zhuǎn)染和熒光觀察將重組質(zhì)粒用LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，熒光顯微鏡下計數(shù)GFP熒光陽性細胞比例并照相。
　　4、流式細胞分析委托河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細胞分析室完成。
　　結(jié)果：
　　1、重組表達載體構(gòu)建和鑒定重組表達載體經(jīng)酶切和測序鑒定正確。
　　2、AA序列解除Alu串連序列對GFP基因的抑制作用C1-AA×2-Alu14，C1-Alu14，

6、pEGFP-C1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細胞做熒光顯微鏡觀察并計數(shù)。熒光細胞陽性率六次試驗均值分別為：C1-AA×2-Alu147.39±0.91％，C1-Alu140.69±0.11％，pEGFP-C180.50±1.33％。
　　C1-AA×2-Alu14和C1-Alu14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的流式細胞儀測定結(jié)果顯示，用HeLa細胞作為對照(熒光強度>100)，C1-Alu14質(zhì)粒熒光陽性的細胞數(shù)為21.47％，C1-AA×2-Alu1

7、4質(zhì)粒熒光陽性的細胞數(shù)為44.96％。如果計算強熒光細胞的比例(熒光強度>102的細胞數(shù)/總的細胞數(shù))，熒光陽性細胞百分數(shù)分別為5.0％和0.1％。這些結(jié)果與熒光陽性計數(shù)結(jié)果呈一致性。C1-AA×2-Alu14能解除Alu14對GFP基因的抑制作用。
　　3、AA序列點突變對GFP基因表達的影響 AA序列點突變后重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細胞做熒光顯微鏡觀察并計數(shù)，熒光細胞陽性率六次試驗均值分別為：C1-AAMFA×2-Alu14

8、3.59±0.27％，C1-AAMFC×2-Alu145.78±1.09％，C1-AAMFG×2-Alu142.95±0.70％，C1-AAMSeA×2-Alu144.02±1.06％，C1-AAMSeC×2-Alu144.28±1.29％，C1-AAMSeG×2-Alu143.70±0.86％，C1-AAMThA×2-Alu147.09±1.60％，C1-AAMThC×2-Alu145.25±1.33％，C1-AAMThG×2-Alu

9、143.02±0.74％，C1-AA×2-Alu147.39±0.91％，C1-Alu140.69±0.11％。
　　流式細胞儀測定結(jié)果顯示，如果計算強熒光細胞的比例(熒光強度>102的細胞數(shù)/總的細胞數(shù))，熒光陽性細胞百分數(shù)分別為：C1-AAMFA×2.Alu141.87％，C1-AAMFC×2-Alu144.22％，C1-AAMFG×2-Alu140.96％，C1-AAMSeA×2-Alu142.35％，C1-AAMSeC×2

10、-Alu142.67％，C1-AAMSeG×2-Alu142.58％，C1-A AMThA×2-Alu144.78％，C1-AAMThC×2-Alu143.26％，C1-AAMThG×2-Alu142.21%，C1-AA×2-Alu145.00％，C1-Alu140.10％。
　　這些結(jié)果與熒光計數(shù)結(jié)果呈一致性，AA序列點突變后重組質(zhì)粒的熒光細胞陽性率均高于Alu串連序列重組質(zhì)粒，但均低于插入AA序列的質(zhì)粒的熒光細胞陽性率。

11、>　　4、本研究室發(fā)現(xiàn)多個增強子，如22R(5’-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT)，4TMI(5’-GTGAAATAAATGCTTTTTTTGT)，AA(5’-GTGAAATAAATGCAAATAAAGT)，5AMI(5’-GTGAATAAAATGCTTTAATTGT)等，這些增強子的共同特點是：以A、T堿基為主，以TGC為中心兩翼有對稱趨勢。為了研究RNA小片段中A、U字符串比例是否也占優(yōu)勢，我們對HeLa等5種細胞中表

12、達基因所產(chǎn)生的RNA小片段組成進行了分析。發(fā)現(xiàn)5種細胞RNA小片段組成中“UUUU”和“AAAA”字符串含量最高，且“UUUU”字符串比例高于“AAAA”字符串。
　　結(jié)論：
　　1、增強子AA序列(5’-GTGAAATAAATGCAAATAAAGT)能解除Alu串連序列對GFP基因的抑制作用，具有活化基因作用。
　　2、對AA中另外3個T堿基位點(2、11、22位)的突變說明，這3個T堿基也對AA的增強子活性產(chǎn)生影響