L1-ORF2不同位置串聯(lián)片段及簡單重復(fù)序列調(diào)節(jié)GFP報告基因表達.pdf

1、目的：人類基因組約有40-50％的序列屬于重復(fù)DNA序列，長散在核元件(long interspersed nuclear elements，LINEs)是其中重要的一種類型。LINEs包括LINE-1(L1)和LINE-2(L2)，前者占據(jù)了人類基因組的16.9％?；蚪M中的L1多數(shù)為不完整序列，且大多數(shù)L1重復(fù)序列在人類基因中以反序形式存在。IL-2基因，T細胞受體基因側(cè)翼含有豐富的L1序列。因為L1在基因組中多數(shù)呈不完整片斷分布，

2、所以有必要研究L1片段對基因表達的影響。L1-ORF2 (L1重復(fù)序列第2讀碼框)按正序方向插入pEGFP-C1 (C1)質(zhì)粒的GFP基因下游，強烈抑制GFP基因表達，反序方向插入則導(dǎo)致GFP轉(zhuǎn)錄提前終止，但并不清楚L1-ORF2的這種特性是其整體特征還是由個別片段造成。為了研究L1-ORF2不同片段對上游基因的影響，將來自Xq13.1位置的L1-ORF2(L1PA3家族)不同位置片段(各280bp)及Alu元件(283bp)的8串聯(lián)體

3、，分別按正、反序方向插入C1質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，Northern雜交和熒光顯微鏡檢測下游序列對GFP基因表達的影響。富含“A”堿基是L1-ORF2的序列特點，“A”堿基含量為40.89％，為了研究富含“A”堿基的簡單重復(fù)序列是否有正、反序列影響GFP基因表達不同的特征，將736bp的(AAACAAA)n或(AG)n按正、反方向插入C1質(zhì)粒，觀察簡單重復(fù)序列對GFP基因表達的影響。 方法： 1. 重組質(zhì)粒構(gòu)建

4、 設(shè)計5對帶合適酶切位點的引物(Table 1)，用RP11-29107克隆作模板，分別擴增5段L1-ORF2片段(各280bp)。PCR擴增片段與C1質(zhì)粒經(jīng)酶切和T4 DNA連接酶連接，獲得5種插入一個片段的重組質(zhì)粒。Xba Ⅰ和Nhe Ⅰ的粘性末端可以用T4 DNA連接酶連接，但是連接后不被Xba Ⅰ和/或Nhe Ⅰ切斷，利用該特性反復(fù)同向串聯(lián)構(gòu)建出含8串聯(lián)片段的重組質(zhì)粒。將8串聯(lián)重組質(zhì)粒插入片段反向插入，篩選出反序重組質(zhì)粒。構(gòu)建

5、缺失3'端序列的ORF2(3212bp)片段反向插入表達載體，命名為p280-1～8as。合成上游帶有EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點，下游帶有Nhe Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位點，中間分別帶有AAACAAA或AG簡單重復(fù)序列的寡核苷酸，引物擴增使其成雙鏈，擴增片段與C1質(zhì)粒經(jīng)酶切后連接，串聯(lián)重復(fù)，獲得含有正、反序簡單重復(fù)序列(736bp)的重組質(zhì)粒，命名為p(AAACAAA)Rep， p(AAACAAA)Repas， p(AG)Rep，p(

6、AG)Repas。 2. 細胞轉(zhuǎn)染 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒和C1質(zhì)粒分別以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HeLa細胞，37℃、5％CO2環(huán)境培養(yǎng)36小時，12孔板細胞用于提取RNA，24孔板細胞用于熒光觀察。 3. Northern雜交 用rrizol提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞總RNA，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，毛細法將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。α-32p標記的GFP探針雜交、沖洗后放射自顯影。尼龍膜用剝離液處理，沖洗后用檢測Neo

7、(neomycin resistancecassette) RNA的探針再次雜交，作為對照。 4. 熒光陽性細胞計數(shù) 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HeLa細胞經(jīng)4％多聚甲醛固定，×100倍視野白光下計數(shù)細胞總數(shù)，同樣視野紫蘭光下計數(shù)熒光陽性細胞數(shù)，計算熒光細胞陽性率。 結(jié)果： 1. 重組質(zhì)粒 1.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 構(gòu)建以下18種重組質(zhì)粒：p280-1*8as，p280-2*8，p280-2*8as，p280

8、-4*8as，p280-5*8，p280-5*8as，p280-7*8，p280-7*8as，p280-8*8，p280-8*8as，p280-9*8，p280-9*8as，pAlu*8as，p280-1～8as，p(AAACAAA)Rep，p(AAACAAA)Repas，p(AG)Rep，p(AG)Repas。經(jīng)酶切(Fig.2，F(xiàn)ig.4)，PCR(Fig.3，F(xiàn)ig.4)，測序(Fig.5，F(xiàn)ig.6，F(xiàn)ig.7)鑒定正確。

9、 1.2 其它 重組質(zhì)粒p280-1*8、p280-4*8、pAlu*8、pORF2及pORF2as為本研究室其它工作構(gòu)建。本研究所使用的全部質(zhì)粒及說明見Table 2。 2. L1-ORF2不同串聯(lián)片段和Alu串聯(lián)序列對GFP報告基因表達的影響 2.1 Northern雜交 分別用L1-ORF2串聯(lián)片段和Alu串聯(lián)正、反序重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，提取總RNA，Northern雜交，結(jié)果(Fig.8)

10、顯示所有L1-ORF2串聯(lián)片段中反序GFP基因的表達均高于正序，Alu與L1-ORF2片段不同，正序的GFP基因表達高于反序；不同串聯(lián)片段轉(zhuǎn)錄終止位置不同，p280-1*8、p280-5*8、p280-9*8、p280-1*8as及p280-9*8as發(fā)生轉(zhuǎn)錄提前終止。 2.2 熒光阻性細胞計數(shù) 選擇p280-1*8、p280-5*8、p280-9*8及相應(yīng)的反序分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞做熒光顯微鏡觀察(Fig.9)，熒光細

11、胞陽性率均值(±SD)分別為：p280-1*8(1.8 1±0.87)％，p280-1*8as(14±4.63)％，p280-5*8(0.51±0.17)％，p280.5*8as(12.5±3.04)％，p280-9*8(2.54±0.59)％，p280-9*8as(11.964-4.54)％。 3. L1-ORF2去除3’端序列后反向插入不發(fā)生GFP基因轉(zhuǎn)錄提前終止 3.1 Northern 雜交 L1-OR

12、F2 反序插入 C1 質(zhì)粒(pORF2as) 出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄提前終止。去除L1-ORF2 3’端序列的反序重組質(zhì)粒(p280.1～8as)與pORF2as不同，不發(fā)生轉(zhuǎn)錄提前終止，而是出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄延伸條帶的量高于提前終止性條帶(Fig.10)。 3.2 熒光陽性細胞計數(shù) pORF2，pORF2.1～8as及pORF2as分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞做熒光顯微鏡觀察(Fig.11)，熒光細胞陽性率分別為：pORF2(0.16±0.03)％，

13、pORF2-1～8as(3.93±0.25)％，pORFas(5.45±1.00)％。 4. 簡單重復(fù)序列對GFP報告基因表達的影響 4.1 Northern 雜交 插入AAACAAA或AG簡單重復(fù)序列反序的GFP基因轉(zhuǎn)錄強度分別高于其正序，且AAACAAA正、反序插入均發(fā)生GFP基因轉(zhuǎn)錄提前終止(Fig.12)。 4.2 熒光陽性細胞計數(shù) p(AAACAAA)Rep，p(AAACAAA)Repa

14、s，p(AG)Rep，p(AG)Repas及C1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細胞做熒光顯微鏡觀察(Fig.13)，熒光細胞陽性率分別為：p(AAACAAA)Rep(2.86±0.25)％，p(AAACAAA)Repas(5.71±0.41)％，p(AG)Rep(2.23±0.47)％，p(AG)Repas(2.86±0.34)％，pEGFP-C1(39±3.67)％。 結(jié)論： 1. 所有pEGFP-C1下游插入的序列均抑制GF

15、P基因表達，但是抑制程度和轉(zhuǎn)錄終止位置不同。 2. L1-ORF2反序出現(xiàn)提前終止，去除L1-ORF2的3’端序列的反序片段不再出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄提前終止，說明L1-ORF2反序?qū)е碌腉FP基因轉(zhuǎn)錄提前終止是由L1-ORF2的3’端部分序列決定的。 3. 插入AAACAAA、AG簡單重復(fù)序列反序的GFP基因轉(zhuǎn)錄強度高于其正序，說明簡單序列在ORF2正、反序影響GFP基因表達特征上起作用。AAACAAA正、反序均引起GFP轉(zhuǎn)錄提前終