SV40 PolyA正、反序列及AATAAA信號(hào)對(duì)上游GFP報(bào)告基因表達(dá)影響.pdf

1、目的：在人類基因組中，有98％的DNA序列屬于非編碼序列，非編碼序列中大約有一半的序列屬于重復(fù)序列，Alu是人類基因組中除LINE-1(long interspersed nuclear elements1，長(zhǎng)散在重復(fù)序列核元件1)以外最主要的重復(fù)序列家族。多腺苷化信號(hào)又稱PolyA信號(hào)(Polyadenylation signal)，AAUAAA(在基因組序列中表示為AATAAA)是其主要形式，參與真核mRNA 3’端形成的重要過(guò)程。

2、已知Alu序列和PolyA信號(hào)與多種生物學(xué)現(xiàn)象關(guān)聯(lián)，如Alu的插入或缺失可引起腫瘤、染色體重組等；而一大類導(dǎo)致地中海貧血的血紅蛋白病都?xì)w因于AAUAAA這個(gè)序列的點(diǎn)突變。 本文中在pEGFP-C1載體的GFP綠色熒光蛋白基因下游插入了14個(gè)同向串連的Alu序列，構(gòu)建p-Alu14質(zhì)粒。又在p-Alu14質(zhì)粒GFP基因下游按正、反方向插入SV40(Simian Virus 40，猴空泡病毒40)PolyA序列(240bp)及去除

3、AATAAA的PolyA序列。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，觀察上游GFP報(bào)告基因綠熒光蛋白表達(dá)變化來(lái)揭示Alu14序列、SV40 PolyA序列以及AATAAA信號(hào)對(duì)上游序列表達(dá)的影響及其作用規(guī)律，為進(jìn)一步研究Alu及PolyA信號(hào)的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1 p-A-Alu14和p-Aas-Alu14載體構(gòu)建與鑒定設(shè)計(jì)上、下游均含有HindⅢ酶切位點(diǎn)的PCR引物，以pEGFP-C1載體為模板，PCR擴(kuò)增位于

4、其多克隆位點(diǎn)下游的SV40 PolyA(以下簡(jiǎn)稱PolyA)序列。將回收純化的PCR產(chǎn)物從HindⅢ酶切位點(diǎn)連接至p-Alu14質(zhì)粒，經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定，得到正、反序列PolyA插入的質(zhì)粒。PolyA正向插入命名為p-A-Alul4，反向插入命名為p-Aas-Alu14。 2 p-△A-Alu14重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定已知正序PolyA序列中有兩個(gè)AATAAA序列，為去除它們，先以pEGFP-C1載體為模板，PCR擴(kuò)增Po

5、lyA序列中第一個(gè)AATAAA的上游序列PolyAa和第二個(gè)AATAAA下游的序列PolyAb。再以重組PCR法融合PolyAa和PolyAb的DNA片斷，制成去除AATAAA的正序PolyA即AA序列。后續(xù)的構(gòu)建及鑒定步驟類似p-A-Alu14質(zhì)粒。構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為p-△A-Alul4。 3 p-△Aas-Alu14重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定已知反序PolyA序列中有一個(gè)AATAAA序列，PCR分別擴(kuò)增PolyA.序列中AATA

6、AA的上游序列PolyAaas和AATAAA的下游序列PolyAbas。重組PCR法融合PolyAaas和PolyAbas的DNA片斷，制成去除AATAAA的反序PolyA即AAas片斷。后續(xù)構(gòu)建步驟同上。構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為p-△A-Alu14。 4 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞及計(jì)數(shù)將上述四種質(zhì)粒、p-Alu14和pEGFP-Cl以脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察GFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，在白光和熒光下分別照相。每種轉(zhuǎn)染細(xì)

7、胞計(jì)數(shù)6個(gè)樣本，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)至少500個(gè)，計(jì)算熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 結(jié)果： 1 重組質(zhì)粒p-A-Alul4和p-Aas-Alu14的鑒定構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶酶切分析，PCR分析和測(cè)序后可知，重組質(zhì)粒p-A-Alu14和p-Aas-Alu14中所插入的片段與預(yù)期長(zhǎng)度一致，核苷酸序列正確無(wú)誤。 2 重組質(zhì)粒p-A-Alul4和p-Aas-Alu14的鑒定去除AATAAA序列的重組質(zhì)粒P-△A-Alul4

8、和p-△Aas-Alu14的測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中所插入的片段是去除AATAAA序列的SV40 PolyA正、反序，核苷酸序列正確無(wú)誤。 3 轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞的熒光計(jì)數(shù)及分析各質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，熒光細(xì)胞陽(yáng)性率均值分別為： p-Alul4 (O.10+0.02608)％ P.A.Alul4 (4.05i0.32094)％ p-Aas-Alu14 (5.08±0.30605)％ p-△A-Alu14 (2.08±0.1

9、9918)％ p-△Aas-Alul4(4.03±0.24221)％ pEGFP-C1(26.5±1.01587)％由此可見(jiàn)，在pEGFP-Cl的GFP基因下游插入14個(gè)串連的Alu序列后，熒光陽(yáng)性率由(26.5±1.01587)％變?yōu)?0.10±0.02608)％，下降十分明顯。PolyA正向插入P-Alu14構(gòu)成的P-A-Alu14質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光陽(yáng)性率(4.05±0.32094)％，PolyA反向插入p-Alu14后構(gòu)建的P-A

10、as-Alu14質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光陽(yáng)性率(5.08±0.30605)％，二者均高于P-Alu14轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性率(0.10±0.02608)％(P<0.01)。去除正序PolyA的AATAAA后構(gòu)成的P-△A-Alu14質(zhì)粒和去除反序PolyA的AATAAA構(gòu)建的P-△Aas-Alu14質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光陽(yáng)性率分別為(2.08±0.19918)％和(4.03±0.24221)％，二者仍然高于p-Alul4轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性率(P<0.01)。

11、 結(jié)論： 1 成功構(gòu)建了在p-Alu14載體中分別插入SV40PolyA正、反序的重組質(zhì)粒。 2 成功構(gòu)建了在P-Alu14載體中分別插入去除AATAAA信號(hào)后的SV40 PolyA正、反序的重組質(zhì)粒。 3 p-Alu14質(zhì)粒中插入的Alu14序列顯著抑制上游GFP報(bào)告基因表達(dá)。 4 p-Alu14的載體GFP基因下游按正、反方向插入SV40PolyA后，原本受Alu14抑制的GFP基因表達(dá)明