日本血吸蟲細胞選擇培養(yǎng)與用SV40大T抗原基因轉染的研究.pdf

1、第一章3種選擇培養(yǎng)基用于日本血吸蟲細胞培養(yǎng)的研究
　　[目的]探索3種選擇培養(yǎng)基對日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,S.j)細胞作選擇培養(yǎng),觀察和鑒定各自對細胞培養(yǎng)的效果,探索通過選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得單一種類血吸蟲細胞的可能性。
　　[方法]分別從感染家兔獲取Sj-12d童蟲和42d成蟲,按常規(guī)方法制備細胞。采用生殖類細胞改良培養(yǎng)基對Sj-12d童蟲和Sj-42d成蟲細胞進行選擇培養(yǎng);同時采用上皮細胞培

2、養(yǎng)基和1640-40綜合培養(yǎng)基對S.j-12d童蟲細胞進行培養(yǎng)。觀察日本血吸蟲細胞經這3種選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后一般生長狀況和形態(tài)特點;通過染色體核型分析、AKP染色、超微結構觀察對培養(yǎng)細胞進行鑒定;利用BrdU摻入法或3H-TdR摻入法檢測部分培養(yǎng)細胞的增殖能力,以及運用Dot-ELISA方法檢測培養(yǎng)細胞的抗原性。
　　[結果]日本血吸蟲細胞經這3種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后,均有不同程度的增殖,細胞分裂相明顯,并且細胞活力狀態(tài)良好。經生殖類

3、細胞改良培養(yǎng)基培養(yǎng)的童蟲和成蟲來源細胞在早期分裂現象明顯,呈葡萄串樣生長繁殖,形成細胞團;第3周可見大量形態(tài)結構相近的細胞呈半貼壁生長狀態(tài)。對培養(yǎng)細胞進行鑒定發(fā)現細胞有DNA合成,染色體具有單倍體和雙倍體兩種核型;AKP染色為強陽性,超微結構鑒定可見胞質中含有大量囊泡狀小體,此為生殖類細胞的特征之一;培養(yǎng)4周細胞開始出現退化死亡。日本血吸蟲童蟲細胞經上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后的鑒定結果顯示:培養(yǎng)3d的細胞出現類上皮樣細胞生長,培養(yǎng)1周呈半貼壁

4、生長;細胞形態(tài)多呈長梭形,結構完整,核質分明,細胞核清晰可見,核仁明顯;超微結構顯示細胞膜完整,細胞器無擴張、水腫現象,核仁和核膜清晰;并且童蟲細胞成分能被血吸蟲細胞免疫血清所識別。根據細胞的形態(tài)特征和抗原性,初步認為經上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的童蟲細胞為上皮類細胞。用1640-40綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)的日本血吸蟲細胞經鑒定后結果顯示:培養(yǎng)細胞分裂相多樣,培養(yǎng)早期(30d)細胞狀態(tài)和活力較好,增殖相明顯;超微結構觀察顯示培養(yǎng)30d細胞形態(tài)結構基本正

5、常,進行細胞活力檢測達到70％;細胞增殖試驗結果顯示細胞具有一定的增殖能力;染色體分析符合血吸蟲二倍體核型;對細胞進行凍存復蘇發(fā)現基本保持細胞原有的特性和活力。
　　[結論]日本血吸蟲混合細胞經生殖類細胞改良培養(yǎng)基和上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后,能使混合細胞中類似生殖類細胞和上皮細胞進行選擇性增殖,并具有該類特定細胞的部分標志性特征,可以達到初步分選細胞的目的,但連續(xù)培養(yǎng)時間不長。1640-40綜合培養(yǎng)基能明顯促進細胞增殖,改善細胞生長狀

6、態(tài),延長細胞在體外的存活時間。
　　第二章SV40大T抗原基因重組腺病毒轉染日本血吸蟲童蟲與其細胞后的效果觀察
　　[目的]構建含SV40大T抗原(SV40LT)基因的重組腺病毒表達載體,觀察重組腺病毒轉染日本血吸蟲童蟲及童蟲細胞后SV40LT基因的表達情況,探討重組腺病毒載體轉染日本血吸蟲童蟲和童蟲細胞的可能性,觀察轉染的外源SV40LT基因對童蟲和童蟲細胞生長狀況以及細胞增殖的影響。
　　[方法]將國外贈送的攜帶S

7、V40LT基因的重組腺病毒質粒(AdHu5-SV40LT)采用熱休克法重新轉化Stb12感受態(tài)菌,獲得重組腺病毒質粒。對質粒用限制性內切酶酶切、PCR擴增法進行鑒定。鑒定正確后的質粒經PacⅠ酶切線性化后用脂質體共轉染293A細胞,待出現細胞病變效應(cell pathological effect,CPE)后收集細胞,經反復凍融細胞離心收集細胞裂解上清,用氯化銫超速離心法對病毒上清進行濃縮和純化,獲得具有感染性的重組腺病毒(Ad-SV

8、40LT)。采用50％細胞培養(yǎng)感染法(50％ cell culture infectious dose,CCID50)測定腺病毒的滴度。日本血吸蟲尾蚴常規(guī)感染家兔獲得12d童蟲,一部分用改良841培養(yǎng)基培養(yǎng),另一部分按常規(guī)方法制備細胞,添加1640-40綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩者均培養(yǎng)3d后用重組腺病毒進行轉染,繼續(xù)培養(yǎng)6～10d分別收集蟲體和細胞,通過PCR、RT-PCR、Western blotting和免疫組織化學方法檢測轉染童蟲及童蟲

9、細胞中SV40L瑾因的轉錄和表達情況。
　　[結果]轉化Stb12感受態(tài)菌后提取的AdHu5-SV40LT質粒經PacⅠ酶切和PCR鑒定為目的質粒。質粒成功轉染293A細胞并可在293A細胞內進行有效的復制;從轉染293A細胞裂解上清中提取病毒DNA進行PCR檢測證實含有SV40LT目的基因;同時Western blotting結果顯示在質粒轉染的293A細胞中有SV40LT蛋白的表達;免疫組織化學染色也證實了同樣的結果。腺病毒轉

10、染的293A細胞裂解上清經氯化銫超速離心濃縮后測得病毒滴度為2.6×109cfu/ml。常規(guī)制備的S,j-12d童蟲細胞用1640-40綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后可見細胞生長狀態(tài)良好,部分細胞分裂相明顯。用重組腺病毒轉染的S.j-12d童蟲及童蟲細胞經PCR檢測均擴增出了外源SV40LT基因558bp的目的產物,進一步用RT-PCR也證實了有目的基因mRNA的轉錄表達;Western blotting檢測結果顯示重組腺病毒轉染的童蟲及其細胞內

11、有SV40LT蛋白的表達;免疫組織化學染色檢測也證實在蟲體被膜下、口腹吸盤以及童蟲細胞內均有該蛋白的表達。病毒轉染后童蟲活力未受影響,而童蟲細胞轉染初期增殖較快,此后生長逐漸減慢,細胞出現崩解、死亡。
　　[結論]用質粒AdHu5-SV40LT和脂質體共轉染293A細胞后,成功獲得了具有感染能力的攜帶外源SV40LT基因的腺病毒;重組腺病毒轉染日本血吸蟲童蟲及童蟲細胞后有目的基因SV40LT的轉錄和蛋白表達,但轉染的外源SV40L