轉(zhuǎn)SV40大T抗原基因昆蟲細(xì)胞系的研究.pdf

1、該研究用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和電穿孔兩種方法,分別將SV40病毒的大T抗原基因轉(zhuǎn)入第80代的Tn5B1-4細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,克隆,共得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆株62株.通過細(xì)胞傳代,選出生長且狀況良好的克隆株共有54株.54株細(xì)胞系分別經(jīng)PBS,AMD處理,病毒滴度和多角體產(chǎn)量比較篩選出10個細(xì)胞克隆株:Tn5B-1-1、Tn5B-1-12、Tn5B-1-15、Tn5B-1-25、Tn5B-1-26、Tn5B-1-30、Tn5B-1-33、Tn5B

2、-2-3、Tn5B-2-9及Tn5B-2-12,這些細(xì)胞系分別接種昆蟲病毒TnGV、TnNPV、MsNPV、PiNPV,其中僅Tn5B-1-12對所測的所有NPV病毒敏感,將此轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系命名為Tn5B-SV-40(簡寫為Tn5B-40).Tn5B-40細(xì)胞形態(tài)主要為紡錘形和圓形,貼壁生長,大小為18.5×42 μ m.增殖很快,群體倍增時間為22小時,最大生長密度可達(dá)2.2×10<'6>cells/ml.對AcMNPV病毒感染率達(dá)95

3、％,多角體產(chǎn)量平均為115 OBs/cell,是一株高產(chǎn)桿狀病毒的細(xì)胞系.Tn5B-40有較強(qiáng)的營養(yǎng)抗逆性,細(xì)胞在無營養(yǎng)的PBS鹽緩沖液中1天以后,Tn5B-40細(xì)胞有70%存活,比野生型Tn5B1-4細(xì)胞高出30%,第5天時,Tn5B1-4細(xì)胞全部死亡,Tn5B-40到第6天仍然有5%存活細(xì)胞.用含不同濃度放線菌素D的培養(yǎng)基處理Tn5B-40細(xì)胞1小時,當(dāng)放線菌素D濃度為0.31,0.62,1.25和2.5μg/ml時,Tn5B-40

4、細(xì)胞的存活率分別比Tn5B1-4高出38%,50%,60%和35%,當(dāng)濃度高達(dá)5μg/ml時,Tn5B1-4細(xì)胞全部死亡而Tn5B-40細(xì)胞仍有30%的生存率.說明此細(xì)胞具有抗凋亡的特性.Tn5B-40是一株高表達(dá)重組蛋白的昆蟲細(xì)胞系.用重組病毒AcMNPV-β-gal侵染細(xì)胞,Tn5B-40細(xì)胞內(nèi)Ⅲ-半乳糖苷酶的產(chǎn)量明顯高于野生型細(xì)胞系,到第六天,其表達(dá)水平達(dá)到Tn5B1-4的2.3倍,第8天時比Tn5B1-4細(xì)胞高出35%,達(dá)3.4

5、×10<'4>IU/ml.隨著時間的延長,Tn5B-40培養(yǎng)基中酶量也逐漸增加,第4天就比第2天提高了5倍.第8天時Tn5B-40細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的酶總表達(dá)水平達(dá)到最高5.4×10<'4>IU/ml.AcMNPV-SEAP感染此細(xì)胞,其細(xì)胞內(nèi)的分泌型堿性磷酸酶表達(dá)水平明顯低于培養(yǎng)基中的表達(dá)水平,最高只達(dá)1 IU/ml.Tn5B-40細(xì)胞分泌在培養(yǎng)基中的SEAP在細(xì)胞培養(yǎng)后期較高,第9天時比Tn5B1-4高出25%.Tn5B-40的SEA