轉核技術建立可增殖神經細胞系的實驗研究.pdf

1、目的：將胎鼠皮質神經元細胞核轉入到骨髓間充質干細胞胞質體中構建轉核細胞，以期望建立一種可增殖的神經細胞系，為腦移植的供體細胞來源探索一條新的途徑。 方法：(1)骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)，用流式細胞儀檢測骨髓間充質干細胞表面標志物CD44、CD90、CD71、CD11b進行鑒定，用免疫細胞化學染色法檢測CD133的表達情況；(2)用梯度離心法制備骨髓間充質干細胞胞質體，并用HE染色、Giemsa染色、免疫熒光雙標法、透射電鏡檢查等方

2、法進行鑒定，用臺盼藍染色檢測其活性；(3)采用胎齡17d的胎鼠進行皮質神經元的分離培養(yǎng)，用免疫組化法檢測神經元MAP2和NeuN的表達情況；(4)用梯度離心法制備神經元細胞核，并用HE染色、免疫熒光染色、透射電鏡檢查等方法進行鑒定，用臺盼藍染色檢測其活性；(5)用PEG介導神經元細胞核與骨髓間充質干細胞胞質體發(fā)生融合構建轉核細胞；(6)用Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標法對轉核細胞進行鑒定；(7)用抗BrdU和Hoechs

3、t33342免疫熒光雙標法檢測轉核細胞是否具有增殖能力，用MTT比色法繪制生長曲線：(8)用掃描電鏡和透射電鏡對轉核細胞進行檢測；(9)用流式細胞儀檢測轉核細胞CD44、CD90、CD71、CD11b等抗原的表達變化；(10)用免疫熒光雙標法和免疫細胞化學染色法檢測轉核細胞NeuN的表達情況；(11)用免疫細胞化學染色法檢測轉核細胞CD133、MAP2、Nestin等抗原的表達情況； 結果：(1)骨髓間充質干細胞呈長梭形、漩渦狀

4、生長，用流式細胞儀檢測骨髓間充質干細胞表面標志物CD44、CD90、CD71陽性，CD11b陰性，免疫細胞化學染色顯示CD133陰性。 (2)HE染色和Giemsa染色顯示骨髓間充質干細胞經梯度離心后在15～18％Ficoll400梯度層可見到大量胞質體，貼壁生長的胞質體呈多邊形或類圓形，體積與完整細胞相比差別不大。Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標染色顯示骨髓間充質干細胞經梯度離心后在15～18％Fieoll400

5、梯度層可見到胞漿呈綠色熒光的胞質體，胞核所在部位無藍色熒光顯示。臺盼藍染色示活胞質體比例為99.5％。12.5～18％Ficoll400梯度層細胞透射電鏡標本可觀察到只有胞漿成分的圓形胞質體，胞漿中有內質網、線粒體等超微結構。 (3)胎鼠皮質神經元呈多角形，伸出多個突起，MAP2染色顯示神經元細胞漿和突起呈免疫反應陽性，NeuN染色顯示神經元細胞核呈免疫反應陽性，部分核周胞質和部分近端突起也呈免疫反應陽性。在培養(yǎng)6h、3d、6d

6、時MAP2和NeuN陽性細胞比例均在90％左右，培養(yǎng)不同時間免疫陽性細胞比例無顯著性差異。 (4)HE染色和Hoechst免疫熒光染色顯示神經元梯度離心后在22～30％ Ficoll400梯度層可見到大量圓點狀細胞核，臺盼藍染色顯示活細胞核比例為99.6％。在22～30％Ficoll400梯度層細胞透射電鏡標本中可觀察到圓形的細胞核，在細胞核的周圍僅見到一層薄薄的胞漿成分。 (5)用PEG可介導神經元細胞核與骨髓問充質干

7、細胞胞質體融合構建轉核細胞，轉核細胞呈梭形或多邊形，少數細胞長出兩個或數個突起，部分轉核細胞呈球狀聚集生長。 (6)轉核細胞Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標陽性，提示細胞核來自神經元，細胞漿來自骨髓間充質干細胞。轉核效率為64.8％。 (7)轉核細胞抗BrdU與Hoechst33342免疫熒光雙標染色陽性。細胞傳代次數和細胞培養(yǎng)天數對轉核細胞MTT值變化具有顯著性影響(p<0.01)。二代和三代轉核細胞MT

8、T值與一代轉核細胞相比明顯增高(p<0.05)。轉核細胞培養(yǎng)第4天的MTT值較培養(yǎng)第1天的MTT值明顯增高，具有顯著性差異(p<0.05)。 (8)掃描電鏡可觀察到神經元細胞核與骨髓間充質干細胞胞質體發(fā)生融合的過程。透射電鏡可觀察轉核細胞核漿比偏大，核膜有較多皺褶，內質網數量多，體積比較寬大。 (9)一至四代轉核細胞CD71、CD90呈陽性，CD11b呈陰性，一代轉核細胞CD44為陰性，隨著傳代次數的增加CD44陽性細胞

9、率逐漸增加，至第四代時CD44陽性細胞率達98.5％。 (10)大多數轉核細胞的胞漿NeuN均呈免疫陽性反應，部分轉核細胞胞漿NeuN呈免疫陽性反應，胞核呈強陽性反應，另有少數轉核細胞僅胞核部位NeuN呈強陽性。第二代轉核細胞NeuN表達較第一代轉核細胞明顯增加(p<0.05)，繼續(xù)傳代NeuN表達逐漸下降，第四代轉核細胞NeuN表達與第二代轉核細胞相比明顯下降(p<0.05)。 (11)部分轉核細胞的細胞膜上出現(xiàn)Nes

10、tin陽性表達。一至四代轉核細胞Nestin表達強弱比較無明顯差異(0>0.05)，但陽性細胞比例逐漸增加。轉核細胞胞漿中CD133表達陽性，一至四代轉核細胞CD133表達水平無顯著性差異(p>0.05)。第一代轉核細胞胞漿中MAP2呈免疫陽性反應，隨傳代次數增加表達水平逐漸減弱，第四代轉核細胞MAP2表達呈陰性反應。 結論：(1)用梯度離心法可制備骨髓間充質干細胞胞質體；(2)用梯度離心法可制備胎鼠皮質神經元細胞核；(3)采甩