轉(zhuǎn)核技術(shù)建立可增殖神經(jīng)細胞系的實驗研究.pdf

1、目的：將胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞核轉(zhuǎn)入到骨髓間充質(zhì)干細胞胞質(zhì)體中構(gòu)建轉(zhuǎn)核細胞，以期望建立一種可增殖的神經(jīng)細胞系，為腦移植的供體細胞來源探索一條新的途徑。 方法：(1)骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物CD44、CD90、CD71、CD11b進行鑒定，用免疫細胞化學染色法檢測CD133的表達情況；(2)用梯度離心法制備骨髓間充質(zhì)干細胞胞質(zhì)體，并用HE染色、Giemsa染色、免疫熒光雙標法、透射電鏡檢查等方

2、法進行鑒定，用臺盼藍染色檢測其活性；(3)采用胎齡17d的胎鼠進行皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)，用免疫組化法檢測神經(jīng)元MAP2和NeuN的表達情況；(4)用梯度離心法制備神經(jīng)元細胞核，并用HE染色、免疫熒光染色、透射電鏡檢查等方法進行鑒定，用臺盼藍染色檢測其活性；(5)用PEG介導(dǎo)神經(jīng)元細胞核與骨髓間充質(zhì)干細胞胞質(zhì)體發(fā)生融合構(gòu)建轉(zhuǎn)核細胞；(6)用Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標法對轉(zhuǎn)核細胞進行鑒定；(7)用抗BrdU和Hoechs

3、t33342免疫熒光雙標法檢測轉(zhuǎn)核細胞是否具有增殖能力，用MTT比色法繪制生長曲線：(8)用掃描電鏡和透射電鏡對轉(zhuǎn)核細胞進行檢測；(9)用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)核細胞CD44、CD90、CD71、CD11b等抗原的表達變化；(10)用免疫熒光雙標法和免疫細胞化學染色法檢測轉(zhuǎn)核細胞NeuN的表達情況；(11)用免疫細胞化學染色法檢測轉(zhuǎn)核細胞CD133、MAP2、Nestin等抗原的表達情況； 結(jié)果：(1)骨髓間充質(zhì)干細胞呈長梭形、漩渦狀

4、生長，用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物CD44、CD90、CD71陽性，CD11b陰性，免疫細胞化學染色顯示CD133陰性。 (2)HE染色和Giemsa染色顯示骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)梯度離心后在15～18％Ficoll400梯度層可見到大量胞質(zhì)體，貼壁生長的胞質(zhì)體呈多邊形或類圓形，體積與完整細胞相比差別不大。Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標染色顯示骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)梯度離心后在15～18％Fieoll400

5、梯度層可見到胞漿呈綠色熒光的胞質(zhì)體，胞核所在部位無藍色熒光顯示。臺盼藍染色示活胞質(zhì)體比例為99.5％。12.5～18％Ficoll400梯度層細胞透射電鏡標本可觀察到只有胞漿成分的圓形胞質(zhì)體，胞漿中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等超微結(jié)構(gòu)。 (3)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元呈多角形，伸出多個突起，MAP2染色顯示神經(jīng)元細胞漿和突起呈免疫反應(yīng)陽性，NeuN染色顯示神經(jīng)元細胞核呈免疫反應(yīng)陽性，部分核周胞質(zhì)和部分近端突起也呈免疫反應(yīng)陽性。在培養(yǎng)6h、3d、6d

6、時MAP2和NeuN陽性細胞比例均在90％左右，培養(yǎng)不同時間免疫陽性細胞比例無顯著性差異。 (4)HE染色和Hoechst免疫熒光染色顯示神經(jīng)元梯度離心后在22～30％ Ficoll400梯度層可見到大量圓點狀細胞核，臺盼藍染色顯示活細胞核比例為99.6％。在22～30％Ficoll400梯度層細胞透射電鏡標本中可觀察到圓形的細胞核，在細胞核的周圍僅見到一層薄薄的胞漿成分。 (5)用PEG可介導(dǎo)神經(jīng)元細胞核與骨髓問充質(zhì)干

7、細胞胞質(zhì)體融合構(gòu)建轉(zhuǎn)核細胞，轉(zhuǎn)核細胞呈梭形或多邊形，少數(shù)細胞長出兩個或數(shù)個突起，部分轉(zhuǎn)核細胞呈球狀聚集生長。 (6)轉(zhuǎn)核細胞Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標陽性，提示細胞核來自神經(jīng)元，細胞漿來自骨髓間充質(zhì)干細胞。轉(zhuǎn)核效率為64.8％。 (7)轉(zhuǎn)核細胞抗BrdU與Hoechst33342免疫熒光雙標染色陽性。細胞傳代次數(shù)和細胞培養(yǎng)天數(shù)對轉(zhuǎn)核細胞MTT值變化具有顯著性影響(p<0.01)。二代和三代轉(zhuǎn)核細胞MT

8、T值與一代轉(zhuǎn)核細胞相比明顯增高(p<0.05)。轉(zhuǎn)核細胞培養(yǎng)第4天的MTT值較培養(yǎng)第1天的MTT值明顯增高，具有顯著性差異(p<0.05)。 (8)掃描電鏡可觀察到神經(jīng)元細胞核與骨髓間充質(zhì)干細胞胞質(zhì)體發(fā)生融合的過程。透射電鏡可觀察轉(zhuǎn)核細胞核漿比偏大，核膜有較多皺褶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量多，體積比較寬大。 (9)一至四代轉(zhuǎn)核細胞CD71、CD90呈陽性，CD11b呈陰性，一代轉(zhuǎn)核細胞CD44為陰性，隨著傳代次數(shù)的增加CD44陽性細胞

9、率逐漸增加，至第四代時CD44陽性細胞率達98.5％。 (10)大多數(shù)轉(zhuǎn)核細胞的胞漿NeuN均呈免疫陽性反應(yīng)，部分轉(zhuǎn)核細胞胞漿NeuN呈免疫陽性反應(yīng)，胞核呈強陽性反應(yīng)，另有少數(shù)轉(zhuǎn)核細胞僅胞核部位NeuN呈強陽性。第二代轉(zhuǎn)核細胞NeuN表達較第一代轉(zhuǎn)核細胞明顯增加(p<0.05)，繼續(xù)傳代NeuN表達逐漸下降，第四代轉(zhuǎn)核細胞NeuN表達與第二代轉(zhuǎn)核細胞相比明顯下降(p<0.05)。 (11)部分轉(zhuǎn)核細胞的細胞膜上出現(xiàn)Nes

10、tin陽性表達。一至四代轉(zhuǎn)核細胞Nestin表達強弱比較無明顯差異(0>0.05)，但陽性細胞比例逐漸增加。轉(zhuǎn)核細胞胞漿中CD133表達陽性，一至四代轉(zhuǎn)核細胞CD133表達水平無顯著性差異(p>0.05)。第一代轉(zhuǎn)核細胞胞漿中MAP2呈免疫陽性反應(yīng)，隨傳代次數(shù)增加表達水平逐漸減弱，第四代轉(zhuǎn)核細胞MAP2表達呈陰性反應(yīng)。 結(jié)論：(1)用梯度離心法可制備骨髓間充質(zhì)干細胞胞質(zhì)體；(2)用梯度離心法可制備胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞核；(3)采甩