鵪鶉原始生殖細(xì)胞系的建立及鑒定.pdf

1、原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，簡(jiǎn)稱(chēng)PGCs)是精子或卵子的前體細(xì)胞，PGCs細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，任何一個(gè)細(xì)胞都具有發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體的潛能，在體外PGCs可誘導(dǎo)分化出包括三個(gè)胚層在內(nèi)的所有分化細(xì)胞，PGCs也具有種系傳遞功能，能與另一個(gè)正常胚胎嵌合，獲得包括生殖系在內(nèi)的動(dòng)物個(gè)體。本研究采用鵪鶉為研究對(duì)象，以雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層及各種生長(zhǎng)因子為基礎(chǔ)，對(duì)5.5天鵪鶉胚胎PGCs的分離、純化、培養(yǎng)進(jìn)行了研究，并對(duì)鵪

2、鶉的PGCs的冷凍保存效果進(jìn)行了探討。 1．雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制作：采用孵化6天的海蘭白種雞蛋為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)培養(yǎng)傳至2-3代后，以絲裂霉素-C處理后所得到的細(xì)胞單層作為飼養(yǎng)層。 2．PGCs的分離及鑒定：本實(shí)驗(yàn)采用孵化5.5天的鵪鶉胚胎，以酶解法消化獲得細(xì)胞。對(duì)其消化時(shí)間做了探討，發(fā)現(xiàn)消化15分鐘所獲得的細(xì)胞數(shù)最多。每枚性腺獲得的細(xì)胞平均為226個(gè)左右，并分別用形態(tài)學(xué)和堿性磷酸酶(.AKP)對(duì)PGCs做了鑒定。

3、 3．PGCs的傳代及培養(yǎng)：分別在無(wú)飼養(yǎng)層，無(wú)生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液中、雞成纖維飼養(yǎng)層及添加LIF\SCF\bFGF的雞成纖維飼養(yǎng)層上對(duì)PGCs進(jìn)行培養(yǎng)。在不含飼養(yǎng)層和生長(zhǎng)因子的飼養(yǎng)層中培養(yǎng)原始生殖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞成纖維狀貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)的時(shí)間很短，不超過(guò)5-6天。原始生殖細(xì)胞置放在雞胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)成上時(shí)，細(xì)胞的分化得到了有效的抑制，前2天原始生殖細(xì)胞仍保持單個(gè)的未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)3天后分化的程度比之無(wú)飼養(yǎng)層的PGCs情況好，PGCs存活50％

4、左右。在添加生長(zhǎng)因子的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，前3天左右細(xì)胞基本不出現(xiàn)分化，保持單個(gè)的未分化狀態(tài)，在4-5天后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)分化，PGCs存活76％左右，培養(yǎng)至第6-7天后，細(xì)胞出現(xiàn)7-8個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞克隆；培養(yǎng)至第10天時(shí)，細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞達(dá)到13-15個(gè)左右，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)不明顯，細(xì)胞間的結(jié)合不緊密，成纖維細(xì)胞大量死亡。本實(shí)驗(yàn)嘗試在第7天進(jìn)行鵪鶉原始生殖細(xì)胞的傳代，對(duì)于鵪鶉PGCs的傳至第5代，細(xì)胞仍具有原始生殖細(xì)胞的形態(tài)，部分細(xì)胞保持分裂增殖

5、能力。 4．PGCs的冷凍與解凍：解凍保存了2個(gè)月的原始生殖細(xì)胞。方法1(DMSO作為冷凍液)解凍后細(xì)胞存活率為61.4％，方法2(EG+PVP作為冷凍液)解凍后細(xì)胞存活率為54.2％(P>0.05)。 以上結(jié)果表明：以酶解法在5.5天鵪鶉性腺中分離到PGCs，將PGCs在添加生長(zhǎng)因子的雞成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)，在第7天對(duì)鵪鶉PGCs進(jìn)行傳代，傳至5代仍有部分細(xì)胞存活并具有分裂增殖的潛能。解凍保存2個(gè)月的鵪鵓PGCs，獲得了較