兔原始生殖細(xì)胞(PGCs)體外培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究.pdf

1、動(dòng)物原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell，PGC)是研究胚胎早期發(fā)育機(jī)理及相關(guān)調(diào)控的理想模型，對(duì)其研究已然成為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域最具活力、最為熱門和前沿的課題之一。動(dòng)物原始生殖細(xì)胞因其無(wú)限增殖、多向分化的能力和遺傳可操作性成為細(xì)胞研究乃至基因治療的理想載體。本研究以14-18d胎兔為試驗(yàn)對(duì)象，體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增PGCs，觀察PGCs的形態(tài)變化及集落形成的過(guò)程，用AKP染色及分子生物學(xué)等方法鑒定兔PGCs，并探索飼養(yǎng)層種

2、類、血清含量、細(xì)胞因子等因素對(duì)兔PGCs分離培養(yǎng)的影響，這也為下一步的建系工作做出了鋪墊。
　　1.本試驗(yàn)選取昆明白近交系小鼠13-15d胎齡胎鼠和日本大耳白兔18-21d胎齡胎兔，體外分離培養(yǎng)其胚胎成纖維細(xì)胞，對(duì)不同代細(xì)胞凍存不同時(shí)間后進(jìn)行復(fù)蘇并計(jì)算復(fù)蘇率、制作生長(zhǎng)曲線。得出以下結(jié)論:①小鼠、兔的P3代胚胎成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活性優(yōu)良，結(jié)構(gòu)形態(tài)、生理功能穩(wěn)定，且傳至P3代的細(xì)胞被純化，更適合作為備用細(xì)胞使用;②經(jīng)短時(shí)間(30d、60d

3、)凍存的P1、P3代MEF和REF復(fù)蘇后其生長(zhǎng)性能并沒有大幅度下降，而P3代相較P1來(lái)說(shuō)細(xì)胞更純，因此可選用P3代MEF、REF短時(shí)間凍存，以便于后續(xù)試驗(yàn)的需要。
　　2.本試驗(yàn)選用的是日本大耳白兔14-18d胎齡胎兔，無(wú)菌剝離生殖嵴，體外分離培養(yǎng)PGCs，并采用酶組織化學(xué)檢測(cè)堿性磷酸酶活性、RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá)等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。將PGCs分別接種于MEF、REF制成的不同密度飼養(yǎng)層來(lái)確定種屬

4、跟密度的最適宜培養(yǎng)條件;當(dāng)培養(yǎng)液中血清含量不同以及是否添加細(xì)胞因子LIF時(shí)，對(duì)于PGC培養(yǎng)的影響，并選出最佳的方案。得出以下結(jié)論:①在14-18d的兔胚胎生殖嵴中均可得到PGCs;②兔原始生殖細(xì)胞接種于用兔胚胎成纖維細(xì)胞所制成的密度為6×104的飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)狀況、集落形態(tài)情況最好，分化速度較慢，此為飼養(yǎng)層的最適條件。③優(yōu)化了培養(yǎng)方案，用此方案可得到更多的集落，且集落維持未分化狀態(tài)的時(shí)間更長(zhǎng)，培養(yǎng)液成分:高糖DMEM+1％NEAA+1％雙