山羊原始生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng).pdf

1、原始生殖細(xì)胞(Primordial Germ Cells，PGCs)在一定條件下維持未分化狀態(tài)，經(jīng)過(guò)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)可以建立胚胎性干細(xì)胞系，稱為胚胎生殖細(xì)胞(EmbryonicGerm Cells，EGCs)，這是繼胚胎癌細(xì)胞(Embryonal Carcinoma Cells，ECCs)和胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)之后發(fā)現(xiàn)的又一多能性干細(xì)胞。本研究以江蘇本地白山羊胎兒的生殖嵴為實(shí)驗(yàn)材料，從PGCs中分

2、離培養(yǎng)得到EGCs，對(duì)其進(jìn)行體外傳代和鑒定等，并且分析了影響山羊PGCs分離培養(yǎng)的一些因素，為本地白山羊ESCs系的建立奠定了一定的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(Mouse embryomc fibroblast cells，MEF)，山羊胎兒成纖維細(xì)胞(Goat embryonic fibroblast cells，GEF)和小鼠睪丸支持細(xì)胞(Mousesertoli cells，MSCs)三種細(xì)胞在體外

3、生長(zhǎng)行為基本相似，貼壁時(shí)間短，增殖迅速。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以10μg/mL絲裂霉素-C處理3 h可以有效抑制GEF的增殖，適宜于飼養(yǎng)層的制作；在短期內(nèi)凍存GEF可以置于-70℃保存，復(fù)蘇率可以達(dá)到培養(yǎng)要求。
　　 2.原始生殖細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)呈鳥(niǎo)巢狀和集落狀，凸起生長(zhǎng)于成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層之上，傳代后EGCs的形狀與PGCs基本相似。
　　 3.以共培養(yǎng)，MEF和GEF作為飼養(yǎng)層的三種培養(yǎng)方式中：在培養(yǎng)基中沒(méi)有添加細(xì)胞因子時(shí)，僅僅能

4、夠觀察到原代集落；在培養(yǎng)基中添加10 ng/mL的LIF時(shí)，只有以GEF為飼養(yǎng)層才能將得到的原代集落傳至二代，其它二種培養(yǎng)方式僅僅可以觀察到原代集落。以MSCs為飼養(yǎng)層時(shí)，添加細(xì)胞因子與否均無(wú)法觀察到原代集落。
　　 4.胎兒生殖嵴在室溫(25℃)下消化15 min，使用0.125％胰酶+0.02％EDTA要比0.25％胰酶+0.04％EDTA效果好，前者消化得到的原代集落要多于后者，差異顯著(P＜0.05)；試驗(yàn)比較了兩種傳代

5、方法對(duì)山羊PGCs傳代的影響，無(wú)論是“挑取集落法”還是“胰酶消化法”，均能將PGCs傳至第二代，兩種方法差異不顯著(P＞0.05)。
　　 5.在培養(yǎng)液中添加不同濃度和種類的因子：①LIF：10 ng/mL；②LIF：20ng/mL；③LIF(10 ng/mL)+SCF(10 ng/mL)；④LIF(20 ng/mL)+SCF(20 ng/mL)，以GEF為飼養(yǎng)層，發(fā)現(xiàn)這四種培養(yǎng)方式對(duì)于原代集落形成率的差異是不顯著的(P＞0.0