雞胚原始生殖細(xì)胞增殖調(diào)控機制的研究.pdf

1、家禽常被用作發(fā)育生物學(xué)研究的動物模型，很多研究致力在更深層次揭示家禽發(fā)育的機理，尤其是生殖系統(tǒng)的發(fā)育，在內(nèi)源性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上力圖通過外源性調(diào)控，以提高家禽的繁殖性能。本實驗以艾維因雞胚為材料，分離了胚胎期原始生殖細(xì)胞(PGC)，并進行了原代和傳代培養(yǎng)及其分化潛能的檢測，探討了多種體細(xì)胞對PGC體外增殖的影響，研究了植物性生物活性物質(zhì)大豆黃酮(DAI)和槲皮素(QUE)對PGC增殖的作用及其胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制。 1．雞胚原始生殖細(xì)胞原

2、代和傳代培養(yǎng)模型的建立 在體視顯微鏡下用玻璃針分離3.5～4d雞胚生殖嵴，用胰蛋白酶+EDTA消化分散組織，以含5％胎牛血清(FCS)的M199培養(yǎng)液進行PGC和體細(xì)胞的共培養(yǎng)，從而建立其原代培養(yǎng)模型，然后將PGC傳代到飼養(yǎng)層上進行傳代培養(yǎng)。結(jié)果表明5％FCS在PGC與體細(xì)胞原代培養(yǎng)中有較好的促增殖作用，而在傳代培養(yǎng)時，添加了5％FCS的培養(yǎng)液和無血清ITS培養(yǎng)液(10μg/ml胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10<'-8>m

3、ol/L亞硒酸鈉的培養(yǎng)液)能較好地維持并促進PGC的存活和細(xì)胞集落數(shù)的增加(P<0.05)；堿性磷酸酶(AKP)和過碘酸雪夫氏反應(yīng)(PAS)及c-kit和SSEA-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色均證實所分離的細(xì)胞為PGC；傳代的PGC在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)60h后增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色呈強陽性，提示培養(yǎng)的PGC具有較強的增殖活性。體外分化實驗表明PGC在去除飼養(yǎng)層和生長因子的情況下能分化成多種細(xì)胞，根據(jù)其形態(tài)可分為神經(jīng)樣細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞和骨骼肌樣細(xì)

4、胞。經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，證實了神經(jīng)元樣和上皮樣細(xì)胞的免疫學(xué)特征，表明培養(yǎng)的PGC具有分化的多能性。上述結(jié)果表明經(jīng)PGC-體細(xì)胞原代共培養(yǎng)后再傳代于飼養(yǎng)層上進行傳代培養(yǎng)的模型可以用作PGC增殖活性和分化潛能的研究。 2．體細(xì)胞對雞胚原始生殖細(xì)胞增殖的調(diào)控作用 為了探討雞胚PGC生長的理想支持體系，實驗采用三種來源于雞不同的體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞)制備飼養(yǎng)層，

5、比較三種體細(xì)胞對PGC生長和增殖的影響。同時在三種體細(xì)胞飼養(yǎng)層上添加FCS、生長因子及白血病抑制因子(LIF)，比較不同生長因子或細(xì)胞因子對PGC生長和增殖的影響。另外，用溴脫氧尿苷(BrdU)摻入顯示細(xì)胞的增殖活性。部分PGC作傳代培養(yǎng)，并添加FCS、LIF和人參皂甙(GS)以研究其對PGC傳代增殖的影響。結(jié)果表明成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層和卵泡顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層對雞胚PGC的存活和增殖效果較骨骼肌飼養(yǎng)層好，PGC數(shù)目明顯多于后者(P<0.05)，

6、且BrdU標(biāo)記染色表明成纖維細(xì)胞要優(yōu)于顆粒細(xì)胞；生長因子和細(xì)胞因子的比較發(fā)現(xiàn)，在三種飼養(yǎng)層上，0.5％FCS+LIF(10ng/ml)組效果最好，其次是ITs組和FCS組。而單獨添加LIF組的效果較差，尤其在顆粒細(xì)胞上表現(xiàn)更明顯(P<0.05)。傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，5～6d后PGC大量增殖，特別是添加了GS(10μg/ml)后形成更大的細(xì)胞團，效果更為明顯。結(jié)果提示：雞胚PGC在雞胚成纖維飼養(yǎng)層上培養(yǎng)效果較好，是雞胚PGC較理想的支持體系；且

7、添加低濃度血清和LIF及抗氧化性營養(yǎng)素GS對PGC的增殖有明顯的促進作用。 3．蛋白激酶A和C系統(tǒng)對雞胚PGC增殖的調(diào)控機制 利用PGC培養(yǎng)模型探討了蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)信號系統(tǒng)在PGC增殖中的作用。傳代培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中分別添加腺苷酸環(huán)化酶激活劑福司克林(FRSK)和佛波酯(PMA)以分別活化PKA和PKC，并與相應(yīng)的抑制劑H<,89>和H<,7>聯(lián)合處理PGC：用BrdU標(biāo)記細(xì)胞的增殖情況。實驗結(jié)果表明F

8、RSK(10<'-7>～10<'-5>M)刺激雞胚PGC的增殖(P<0.05)，這種效應(yīng)可被H89(10<'-5>M)所抑制(P<0.05)；PMA(10<'-8>M)也能顯著促進PGC的增殖，其促增殖作用可被H<,7>(10<'-7>～10<'-5>M)所抑制(P<0.05)。BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測表明FRSK及PMA處理后細(xì)胞Brd[J標(biāo)記指數(shù)明顯增高，說明PGC具有較強的增殖活性，從而證明了PKA和PKC信號通路在雞胚PGC的

9、增殖過程中起著重要的調(diào)控作用。 4．類黃酮對雞胚PGC增殖的調(diào)控及其機制的研究 利用PGC傳代培養(yǎng)模型研究兩種類黃酮DAI和QuE對雞胚PGC增殖的影響，并探討了其作用機制。結(jié)果表明，DAI(1μg/ml)和QUE(0.01～1μg/ml)顯著促進PGC的增殖(P<0.05)；到10μg/ml時二者對細(xì)胞發(fā)生毒性作用。利用次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(HX/XO)系統(tǒng)產(chǎn)生自由基，發(fā)現(xiàn)HX/XO系統(tǒng)對PGC造成嚴(yán)重的氧化損傷作用

10、，PGC數(shù)目明顯減少(P<0.05)。DAI或OUE能抑制HX/XO的氧化損傷作用，且兩種氧化指標(biāo)SOD或GSH水平的檢測也表明DAI和QuE能顯著減緩由HX/XO系統(tǒng)造成的氧化破壞作用。實驗還表明DAI和QuE可通過PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響PGC增殖。DAI和QUE(1μg/ml)分別與10<'-5>M的H<,89>聯(lián)合作用后，H<,89>可顯著抑制PGC的增殖(P<0.05)。BrdU標(biāo)記指數(shù)也證實了DAI和QUE的作用。另外，實驗還

11、證實DAI和QUE并非通過雌激素樣效應(yīng)作用于PGC。結(jié)果提示DAI和OUE通過抗氧化和PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種方式促進PGC的增殖。 以上實驗結(jié)果表明：從雞胚生殖嵴分離的PGC與體細(xì)胞原代共培養(yǎng)，再傳代于雞胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上所建立的傳代PGC培養(yǎng)模型可用于PGC增殖和分化調(diào)控的研究，經(jīng)AKP、PAs及c-kit和SSEA-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色等多種方法證實了PGC的原始性和體外分化的多能性。在此模型上發(fā)現(xiàn)PKA和PKC信號通路介導(dǎo)了P