雞胚胎生殖細胞多向分化調(diào)控的研究.pdf

1、與哺乳動物相比，雞胚具有易于獲取和操作、結合病毒轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)移可進行轉(zhuǎn)基因操作等優(yōu)勢，因而常被作為發(fā)育生物學和屺較醫(yī)學研究的模型動物。尤其是近年來有關雞胚各種組織器官發(fā)育分子機理的研究進展較快，這為雞胚更好的作為模型動物奠定了一定的基礎。為了更深層次揭示細胞發(fā)育和分化的機理，在內(nèi)源性調(diào)節(jié)的基礎上力圖通過外源性調(diào)控，在體外獲得干細胞來源、可用于組織功能修復的組織和器官，本實驗以艾維因雞胚為材料，分離了胚胎期原始生殖細胞（primordial

2、 germ cell，PGC）并通過傳代培養(yǎng)獲得了大量胚胎生殖(embryonic germ cell，EG)細胞，建立了EG細胞體內(nèi)形成畸胎瘤及體外形成類胚體(embryoid body，EB)的模型，探討了多種因素對EG細胞體外多向分化的調(diào)控，研究了EG細胞體外向成熟神經(jīng)細胞、脂肪細胞、肝細胞和心肌細胞分化的潛能。
　　 1.雞胚胎生殖細胞分離和培養(yǎng)模型的建立
　　 在體視顯微鏡下用玻璃細針分離3.5～4日胚齡雞胚生

3、殖嵴部位，用胰蛋白酶-EDTA消化分散組織，然后將分散的細胞進行培養(yǎng)以建立PGC的原代培養(yǎng)模型。所用的高糖DMEM培養(yǎng)液中添加5％胎牛血清(FCS)、10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、10ng/ml堿性成纖維生長因子(bFGF)、10ng/ml干細胞生長因子(SCF)、0.lmmol/L MEM非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、2mmol/LL-谷氨酰胺(Gln)、100IU/mi青霉素和100μg/ml鏈霉素（完全培

4、養(yǎng)液）。與體細胞共培養(yǎng)5d后，利用RT-PCR方法檢測PGC特異性基因Cvh、Dazl和DEH在原代培養(yǎng)形成的PGC集落中的表達。將表達PGC特異基因的集落進行傳代培養(yǎng)，然后用過碘酸雪夫氏反應(PAS)、SSEA-1和SSEA-3及SSEA-4免疫組化、和干細胞多能性相關基因PouV.Nanog和Sox2 RT-PCR檢測均證實傳代后形成的集落為EG陽性克隆。上述結果表明，PGC-體細胞原代及傳代共培養(yǎng)并添加多種因子的條件下，PGC在體

5、外可轉(zhuǎn)變?yōu)镋G細胞，這為研究生殖干細胞的分化機制提供了細胞來源。
　　 2.雞胚胎生殖細胞體內(nèi)形成畸胎瘤
　　 通過灌飼具有免疫抑制作用的藥物環(huán)孢素A(CsA，5 mg/kg)制作免疫抑制雛雞，將含有1.0×10?個雞EG細胞的PBS注射到受劍免疫抑制的雛雞皮下，觀察其分化情況。5周后取皮下形成的組織瘤進行切片和HE染色及免疫組化染色鑒定。結果表明，EG細胞在免疫缺陷的雛雞皮下可自發(fā)分化為含有神經(jīng)細胞、軟骨細胞、脂肪細胞

6、、血管、骨細胞、平滑肌、橫紋肌和腺上皮細胞等三個胚層來源的多種細胞類型的畸胎瘤。而注射同樣數(shù)量EG細胞到未飼喂環(huán)孢素A組（模型對照組）和注射不含有EG細胞的免疫抑制雛雞組（細胞對照組）均未觀察到組織瘤的形成。上述結果表明通過飼喂免疫抑制作用的藥物環(huán)孢素A可制作免疫抑制雛雞模型，本實驗利用此模型證明了雞EG細胞在體內(nèi)具有多向分化為含有三個胚層來源細胞畸胎瘤的潛能，這為開展生殖干細胞體內(nèi)分化潛能的研究提供了實驗平臺。
　　 3.雞胚

7、胎生殖細胞體外形成EB模型的建立與優(yōu)化
　　 將EG克隆與體細胞進行胰酶消化，并利用差速貼壁方法富集EG細胞。然后無飼養(yǎng)層、無LIF和β-巰基乙醇條件下將雞EG細胞接種到涂有1％瓊脂的培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)形成EB。形崴的EB進行丫啶橙(AO)染色后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察其內(nèi)部結構。對形成7d和14d的類胚體分別進行切片和HE組織學染色，薨通過RT-PCR檢測內(nèi)胚層標志基因AFP、外胚層標志基因Sox3、中胚層標志基因GATA6和滋

8、養(yǎng)層標志基因Cdx2在其中的表達。結果表明：將富集的雞EG單細胞采用不含LIF的培養(yǎng)液進行懸浮培養(yǎng)4～7d可形成簡單EB，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)則其內(nèi)部形態(tài)也發(fā)生改變，最終形成囊狀EB。不同時間點的EB切片顯示隨著時間的變化，EB中出現(xiàn)含有神經(jīng)細胞、脂肪細胞和胰腺細胞等三個胚層的細胞類型。此外，在體外懸浮培養(yǎng)時比較了FCS和Gln對EB形成的影響。統(tǒng)計顯示，隨著懸浮培養(yǎng)時間的延長，EB的面積不斷增大，F(xiàn)CY濃度和Gin添加量對EB的形成旁生影響顯

9、著，其中以含15％FCS、2 mmoi/L Gln的培養(yǎng)液中EB的形成數(shù)量和狀態(tài)較好。同時，在EG細胞體外分化形成EB的第0d、3d、5d和10d分別檢測多能性相關基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如PouV,Nanog和Sox2 mRNA的表達。結果顯示：在EB體外分化過程中，調(diào)控干細胞多能性和自我更新的三個重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)子PouV、Nanog和Sox2表達量均呈明顯下調(diào)趨勢，提示PouV、Nanog和Sox2在維持雞EG細胞多潛能性中起著重要作用。上

10、述結果表明，雞胚EG細胞通過懸浮培養(yǎng)方法可制備具有向三個胚層分化能力的EB，此結果為研究EG細胞體外定向誘導分佬為特定的細胞類型奠定了實驗基礎。
　　 4.雞胚EG細胞體外多向分化調(diào)控的研究
　　 在貼壁培養(yǎng)條件下，利用含10? mol/L RA的ITS誘導液可將EG細胞定向誘導分化為表達成熟神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞特異蛋白及基因的神經(jīng)細胞。部分神經(jīng)元經(jīng)免疫組化及RT-PCR方法鑒定，表明其具有合成多巴胺和膽堿能

11、神經(jīng)遞質(zhì)的功能。利用10μg/ml胰島素、1μmol/L地塞米松和0.2mmol/L吲哚美辛聯(lián)合處理，可誘導EG細胞定向分化為含有大量脂滴并表達脂肪細胞特異性基因PPARγ'、GLUTI和LPL的成熟脂肪細胞。利用與肝細胞條件培養(yǎng)聯(lián)合培養(yǎng)的方式可定向誘導EG細胞分化為肝細胞，利用PAS染色、免疫細胞化學、RT-PCR方法鑒定EG誘導來源的肝細胞，提示EG細胞具有分化為含有糖原并分泌白蛋白功能的成熟的肝細胞。利用添加去甲基化試劑5-aza

12、的培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，可將EG細胞誘導分化為心肌細胞，表明5-aza具有顯著提高形成規(guī)律性收縮EB比例的作用，其中以添加5μmol/L5-aza組形成的比例最高。形成的EB經(jīng)貼壁分化培養(yǎng)后，采用透射電鏡觀察、熒光免疫組化及RT-PCR方法鑒定EG細胞來源的心肌細胞，結果顯示5-aza可誘導EG細胞分化為含有肌小結和縫隙連接、表達心肌細胞特異性蛋白和標志基因的心肌細胞。
　　 以上實驗結果表明：從雞胚生殖嵴分離的PGC與體細胞原代共培

13、養(yǎng)并經(jīng)傳代所建立的培養(yǎng)模型可用于EG細胞制備和分化調(diào)控的研究，經(jīng)PAS組化、SYEA-1和SSEA-3及SSEA-4免疫細胞化學染色、干細胞多能性相關基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PouV、Nanog和Sox2的RT-PCR法檢測、在免疫抑制雛雞體內(nèi)形成含有三個胚層來源細胞的畸胎瘤等多種方法均證實了EG細胞的干細胞特性。將富集的雞EG細胞懸浮培養(yǎng)形成簡單EB和囊狀EB，培養(yǎng)液中添加15％FCS和2mmol/L Gln可促進EB的形成。在EB體外分化過

14、程中，PouV,Nanog和Sox2表達量均呈明顯下調(diào)趨勢，而三個胚層的標志基因AFP、Sox3和GA TA6及滋養(yǎng)層標志基因Cdx2出現(xiàn)表達，表明EG細胞通過懸浮培養(yǎng)方法可制備具有向三個胚層分化能力的EB。貼壁培養(yǎng)的EB經(jīng)不同的誘導劑處理后，經(jīng)細胞特異性的標志基因或蛋白的表達鑒定，EB可定向分化成有功能的神經(jīng)細胞、脂肪細胞、肝細胞及心肌細胞。以上結果提示利用所建立的EG/EB體外制備和定向誘導分化模型可用于生殖干細胞發(fā)育調(diào)控機制的研究