人胚胎生殖細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化及質(zhì)譜分析研究.pdf

1、目的:1.建立以人胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層體外培養(yǎng)、擴(kuò)增人胚胎生殖細(xì)胞(human embryonic germ cells,hEGCs,人EG細(xì)胞)的方法。2.利用抗壞血酸誘導(dǎo)人胚胎生殖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化；3.探討人胚胎生殖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變。
　　 方法:取5-10周人胚胎生殖腺嵴,組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人EG細(xì)胞；取同一胚胎來(lái)源的人胚胎成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層,傳代培養(yǎng)人EG細(xì)胞。將生長(zhǎng)良好的人EG細(xì)胞,接種

2、于細(xì)菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸浮培養(yǎng),7天后將形成的擬胚體置于明膠包被的24孔培養(yǎng)板中,加入含0.1mg／ml抗壞血酸的誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),用免疫熒光法檢測(cè)誘導(dǎo)2周后細(xì)胞中心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的表達(dá)。分別提取人EG細(xì)胞和誘導(dǎo)2周后細(xì)胞的蛋白質(zhì),采用iTRAQ試劑對(duì)蛋白樣品進(jìn)行差異標(biāo)記(114標(biāo)記誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白組、115標(biāo)記人EG細(xì)胞蛋白組)、液相色譜(LC)分離這2組樣品的總蛋白、串聯(lián)質(zhì)譜(MS／MS)鑒定人EG細(xì)胞和誘導(dǎo)后細(xì)胞差異表達(dá)的

3、蛋白。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)的人胚胎成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,生長(zhǎng)狀態(tài)良好。以同源人胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層傳代培養(yǎng)的人EG細(xì)胞增殖旺盛,其集落呈典型的“鳥(niǎo)巢狀”,和原代培養(yǎng)形成的克隆大小無(wú)明顯區(qū)別,目前已傳到第6代。人EG細(xì)胞經(jīng)抗壞血酸誘導(dǎo)2周后,陽(yáng)性表達(dá)cTnT,細(xì)胞呈多邊形。質(zhì)譜分析共鑒定出349種蛋白(蛋白置信度>95％),其中27種蛋白(21種上調(diào)蛋白、6種下調(diào)蛋白)在人EG細(xì)胞和誘導(dǎo)后細(xì)胞中差異顯著(差異倍數(shù)>3)。