雞胚原始生殖細(xì)胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、近年來(lái),作為精子和卵子的祖細(xì)胞的原始生殖細(xì)胞(PGCs)已成為另一種可選擇的多能性干細(xì)胞.來(lái)源于PGCs的干細(xì)胞稱(chēng)胚胎生殖細(xì)胞.迄今為止僅在小鼠上獲得PGCs來(lái)源的真正意義上的胚胎干細(xì)胞(ES cells)即具有參與生殖系傳遞能力的ES細(xì)胞.取孵化5.5~6.5天含PGCs的雞胚生殖腺及其周?chē)M織,經(jīng)0.25﹪胰酶+0.02﹪EDTA消化后,接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi).加入新鮮的EG細(xì)胞培養(yǎng)液(含DMEM、胎牛血清、雞血清、β-巰基乙醇、L-

2、谷氨酰胺、HEPES、雞胚浸出液以及細(xì)胞因子等成分)培養(yǎng)24小時(shí)以后,PGCs開(kāi)始部分貼附于共培養(yǎng)的生殖原基細(xì)胞上.培養(yǎng)3~4天的PGCs大多已轉(zhuǎn)變?yōu)橛?~20細(xì)胞構(gòu)成的集落,其中包括從PGCs群集或細(xì)胞本身增殖所形成的兩種集落類(lèi)型.培養(yǎng)至5~7天,類(lèi)EG克隆數(shù)目明顯增加.類(lèi)EG細(xì)胞克隆呈規(guī)則的集落狀生長(zhǎng),多層分布,且有明顯的花紋.克隆內(nèi)的細(xì)胞間并不緊密排列,因此不難看出克隆內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞.這與經(jīng)典的小鼠胚胎生殖細(xì)胞的形態(tài)有所不同.研究中

3、分離得到的雞類(lèi)EG細(xì)胞經(jīng)PAS染色后呈深紫紅色,而雞胚成纖維細(xì)胞并不著色.將消化分散的類(lèi)EG細(xì)胞在無(wú)分化抑制因子的類(lèi)EG培養(yǎng)基中重懸培養(yǎng),3~4天后,可見(jiàn)部分細(xì)胞團(tuán)形成簡(jiǎn)單的胚體.在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的類(lèi)EG細(xì)胞集落,在去除抑制分化因子的條件下培養(yǎng),長(zhǎng)時(shí)間不傳代,可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,自發(fā)分化,首先表現(xiàn)為失去原有的形態(tài),進(jìn)而與周?chē)?xì)胞界限不清,集落外圍的細(xì)胞與飼養(yǎng)層連成一片.最后將傳至3代、4代的類(lèi)EG細(xì)胞集落離散后制作嵌合體,得到了一只毛色嵌合