雞原始生殖細(xì)胞形成過程中C2EIP功能及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、PGCs(Primordial germ cells，PGCs)是精子和卵子的祖細(xì)胞，能夠?qū)⑦z傳信息從親代傳遞給子代的干細(xì)胞，保證了種系間遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定傳遞。近年來，通過探究PGCs發(fā)生的具體過程，揭示生殖細(xì)胞發(fā)育過程中關(guān)鍵基因的分子作用及其機(jī)制已逐漸成為生殖生物學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點。研究PGCs分化具有重要意義:(1)對畜牧學(xué)而言，研究動物生殖干細(xì)胞分化過程有助于解決畜牧種質(zhì)的選配選育問題;(2)對人類而言，詳細(xì)了解生殖分化機(jī)理能夠為不

2、孕不育等疾病提供根本解決方法。然而無論是解決哪方面的問題，都需要建立在全面了解生殖過程中細(xì)胞發(fā)育事件和相關(guān)基因作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，只有這樣才能從根本上解決畜牧學(xué)和人類生殖相關(guān)性狀的相關(guān)問題。
　　然而，目前由于對PGCs的發(fā)育調(diào)控機(jī)制缺乏深入探索，導(dǎo)致體外誘導(dǎo)效率低下，難以獲得數(shù)量多且質(zhì)量高的PGCs，極大的限制了PGCs的利用;因此，亟需對PGCs的發(fā)生發(fā)育機(jī)理進(jìn)行深入的研究?；诖耍菊n題組前期已經(jīng)對體內(nèi)正常發(fā)育過程中的胚胎干細(xì)

3、胞(Embryonic stem cells，ESCs)、PGCs和精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)進(jìn)行了全基因組轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了一些影響PGCs形成的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵信號通路，而C2EIP(Chromosome2，Expression In PGCs)就是其中一個最具有顯著性差異表達(dá)的關(guān)鍵基因;C2EIP在PGCs中高表達(dá)，而在ESCs和SSCs中低表達(dá)，推測該基因可能參與了PGCs的發(fā)育調(diào)控

4、。
　　為了系統(tǒng)的研究C2EIP基因的功能。本研究中，我們以家雞為研究對象探索C2EIP在PGCs形成過程中的功能;利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究C2EIP基因的作用以及研究C2EIP在不同細(xì)胞中差異表達(dá)的影響因素;利用GST-Pull Down，質(zhì)譜分析，免疫共沉淀等實驗技術(shù)研究C2EIP的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究結(jié)果如下:
　　(1) C2EIP的發(fā)現(xiàn)、克隆及生物信息學(xué)分析對ESCs、PGCs和SSCs

5、的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)C2EIP在PGCs中特異高表達(dá)，在ESCs和SSCs中不表達(dá)，RT-PCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致;生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)C2EIP主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，存在磷酸化和糖基化位點;C2EIP CDS序列在不同物種間保守型較差，禽類中保守性較高;C2EIP具有泛素化連接酶E3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體功能，初步推斷C2EIP行使類似酶的功能;
　　(2) CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)介導(dǎo)家雞C

6、2EIP敲除體系建立根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的C2EIP CDS序列，設(shè)計3個gRNA靶位點，命名為gRNA1，gRNA2，和gRNA3并連入改造后的VK001-08載體中，通過SSA活性檢測發(fā)現(xiàn)gRNA3對靶位點的敲除活性(Value:0.6924±0.07)是對照組(Value:0.3724±0.12)的近2倍(P＜0.01)，但gRNA1(Value:0.3813±0.27)和gRNA2(Value:0.3718±0.09)對相應(yīng)靶

7、位點的敲除活性與對照組(Value:0.3912±0.32)之間相比沒有差異(P＞0.05)，即沒有敲除活性;將CRISPR/Cas9-gRNA3轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的DF-1細(xì)胞后提取DNA，通過T7E1酶切檢測發(fā)現(xiàn)gRNA3在DF-1細(xì)胞中對C2EIP的敲除效率為27％，TA克隆測序結(jié)果表明30個測序菌液中有8個菌液出現(xiàn)不同數(shù)目的堿基缺失或增加，初步估計基因敲除效率為26％;將CRISPR/Cas9-gRNA3轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的ESCs

8、后進(jìn)行T7EI酶切檢測發(fā)現(xiàn)敲除效率為20％，同時CRISPR/Cas9-gRNA3能夠在雞胚中順利表達(dá)并在心臟表達(dá)水平最高，且載體在雞胚中整合后基因敲除效率達(dá)15％;
　　(3)體內(nèi)外研究C2EIP在PGCs形成過程中的功能克隆C2EIP CDS全長，并成功構(gòu)建PCDNA3.0-C2EIP過表達(dá)載體和C2EIP-N1融合表達(dá)載體;C2EIP-N1融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)位置，發(fā)現(xiàn)C2EIP在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá);針對

9、C2EIP CDS序列，設(shè)計抗原表位，合成多肽并腹腔免疫小鼠制備單克隆抗體，IFA檢測抗體效價為1∶10，且抗體抗原反應(yīng)也發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中;通過體內(nèi)和體外兩個水平研究C2EIP在PGCs形成過程中的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn):體外實驗過程中，在過表達(dá)組誘導(dǎo)6天后能出現(xiàn)生殖樣細(xì)胞，且生殖標(biāo)記基因有顯著性的上調(diào)表達(dá)(P＜0.01)，敲除組在相同的情況下則不能。流式細(xì)胞分選結(jié)果表明基因敲除后CVH陽性細(xì)胞數(shù)量減少(4.8±0.16％)，過表達(dá)反而增加(18

10、.6±0.13％)，熒光定量實驗結(jié)果也顯示C2EIP敲除后PGCs的標(biāo)記基因Cvh的表達(dá)(Value:2.8254±0.31)與正常組(Value:3.1425±0.66)相比出現(xiàn)了顯著的下調(diào)(P＜0.01);體內(nèi)實驗過程中，注射過表達(dá)載體后的雞胚發(fā)育與對照相比沒有顯著差異，但是在第4.5天Cvh的表達(dá)顯著提高(P＜0.01)。對4.5天的雞胚進(jìn)行冰凍切片后利用Cvh和C-KIT特異抗體進(jìn)行免疫組化實驗，結(jié)果表明注射敲除載體后產(chǎn)生的PG

11、Cs數(shù)量顯著的低于正常發(fā)育組和注射過表達(dá)載體的實驗組。正常組和過表達(dá)組中腎發(fā)育完全可見，而在敲除組中無法觀察到完整的中腎結(jié)構(gòu);
　　(4)探索影響C2EIP差異表達(dá)的因素克隆C2EIP啟動子序列并連入EGFP-N1載體構(gòu)建P C2EIP-E GFP表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染DF-1后可以觀察到EGFP綠色熒光，這就說明克隆的C2EIP啟動子區(qū)域具有啟動活性;通過5'端逐步缺失技術(shù)克隆C2EIP啟動子不同長度片段，并構(gòu)建PGL3/787(-

12、891～-94bp)、PGL3/588(-682～-94bp)、PGL3/374(-468～-94bp)、PGL3/170（-264～-94bp）載體，并通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)C2EIP啟動子核心區(qū)域為-264～-94bp;對啟動子核心區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)STAT1、STAT10、Sox17、Sox2和Klf5轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，對這些位點進(jìn)行點突變實驗同時構(gòu)建相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體，通過雙熒光素報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)STAT1

13、能夠正向調(diào)節(jié)C2EIP啟動子活性;STAT10，Sox17，Sox2和Klf5負(fù)向調(diào)節(jié)C2EIP啟動子活性;在轉(zhuǎn)染了PGL3/787載體的DF-1細(xì)胞的培養(yǎng)基中分別添加TSA和5Azacd，雙熒光素報告系統(tǒng)檢測結(jié)果表明:降低DNA甲基化水平和提高組蛋白乙?；侥軌蛱岣逤2EIP啟動子活性;
　　(5)研究C2EIP調(diào)節(jié)PGCs形成過程的分子調(diào)控機(jī)制構(gòu)建C2EIP的原核融合表達(dá)載體，并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和純化，C2EIP原核融合

14、表達(dá)載體能夠在原核表達(dá)菌株中順利表達(dá);通過GST-Pull Down和質(zhì)譜分析成功獲取與C2EIP蛋白的互作蛋白，分別是: PTCH2，KRT75, H2B-Ⅷ, KRT12, Histone H3, SLC25A6, LYZ, VDAC2, HistoneH1,EF-1α, KRT19;通過Western Blot，Co-IP和間接免疫熒光驗證了GST-Pull Down互作的準(zhǔn)確性并確認(rèn)C2EIP與PTCH2蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜發(fā)生互作形

15、成復(fù)合物;通過Co-IP技術(shù)對體外和體內(nèi)不同C2EIP處理下的PTCH2進(jìn)行沉淀并通過Western Blot檢測PTCH2的磷酸化和泛素化水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):高表達(dá)C2EIP能夠降低PTCH2蛋白的磷酸化水平和降低PTCH2蛋白泛素化水平;成功構(gòu)建PTCH2干擾表達(dá)載體shRNA-PTCH2-1，shRNA-PTCH2-2，shRNA-PTCH2-3;同時驗證出shRNA-PTCH2-3對PTCH2蛋白具有較好的抑制效果;通過體內(nèi)和體

16、外驗證實驗發(fā)現(xiàn):抑制HH信號通路能夠抑制PGCs的形成（RA:3.8±0.23％;RA+shRNA-IHH:12.9±0.08％;P＜0.01），反之，激活HH信號通路則能夠促進(jìn)PGCs的形成（RA:3.8±0.23％;RA+shRNA-PTCH2:15.6±0.17％; P＜0.01），結(jié)合上述實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)IHH與PTCH2蛋白結(jié)合，改變PTCH2活性成分表達(dá)水平從而調(diào)節(jié)HH信號參與PGCs形成，而C2EIP也可以與PTCH2結(jié)合