兔類ES細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化.pdf

1、兔作為一種動物模型，其ES細(xì)胞及其培養(yǎng)體系研究較少，本試驗在借鑒其他動物ES細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上，探討兔ES細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的最優(yōu)方案。本試驗分別從胚胎處理方式、培養(yǎng)液成分及飼養(yǎng)層密度等方面對兔類ES細(xì)胞分離培養(yǎng)時的影響進(jìn)行比較。試驗結(jié)果如下:
　　1.對兔囊胚進(jìn)行不同方式處理。結(jié)果顯示，所得不同狀態(tài)的囊胚，其培養(yǎng)效果不同。不經(jīng)處理的兔完整囊胚，體外培養(yǎng)8～9 d才有貼壁現(xiàn)象，ICM不增殖。挑破透明帶組，72 h左右能夠能夠完全孵出并

2、開始貼壁，并且在ICM形成率，及兔類ES細(xì)胞生長克隆率方面顯著高于其他兩組（P＜0.05），最高傳至7代。
　　2.探討超數(shù)排卵對家兔囊胚體外發(fā)育能力的影響，收集自然發(fā)情和超數(shù)排卵處理交配96 h后兔囊胚，以小鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層進(jìn)行培養(yǎng)，以自然發(fā)情交配所得兔囊胚為對照。結(jié)果顯示超數(shù)排卵組囊胚貼壁率、ICM形成率、F1代形成率與自然發(fā)情組無顯著差異（P＞0.05）。兔超數(shù)排卵所獲得的囊胚對其體外發(fā)育能力無顯著影響。
　　3.

3、不同培養(yǎng)基對兔囊胚克隆、傳代的影響，結(jié)果顯示，三組囊胚均在培養(yǎng)72 h左右開始貼壁，囊胚在含血清的培養(yǎng)基中囊胚貼壁率、ICM形成率和F1形成率均顯著高于其他兩組(P＜0.05);但在后續(xù)的傳代過程中，血清與血清替代品等比例混合的培養(yǎng)基較好的維持兔類ES細(xì)胞的形態(tài)，傳代數(shù)高。
　　4.探討小鼠胚胎成纖維細(xì)胞接種密度對兔類ES細(xì)胞分離培養(yǎng)影響，將兔囊胚分別接種到密度分別為10×103·cm-2、20×103·cm-2和40×103·c

4、m-2的飼養(yǎng)層上，結(jié)果顯示接種于密度為20×103·cm-2飼養(yǎng)層上形成的兔類ES細(xì)胞F1、F2代細(xì)胞克隆率均顯著高于其他兩組（P＜0.05）傳代效果最佳。
　　5.對所得的兔類ES細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，堿性磷酸酶染色及Oct-4及Nanog免疫組化染色ES集落呈強陽性，提取ES細(xì)胞集落的RNA，經(jīng)RT-PCR檢測，得到與預(yù)期大小一致的目的片段。
　　故在體外培養(yǎng)兔類ES細(xì)胞時，我們可以同時超數(shù)排卵方式獲得足夠的實驗材料，