兔髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立及TGF-β1對(duì)其生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：探討兔髓核細(xì)胞體外單層培養(yǎng)的適宜條件，并觀察一種自行構(gòu)建的Ⅱ型膠原支架上立體培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞的變化和10ng/mlrhTGF-β1對(duì)其生物學(xué)行為的影響。 方法： 單層培養(yǎng)：改變單層培養(yǎng)條件(培養(yǎng)瓶是否鋪被PLL、培養(yǎng)液pH、胎牛血清濃度、rhTGF-β1濃度)，利用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法，決定兔髓核細(xì)胞體外單層培養(yǎng)的適宜條件。 立體培養(yǎng)：將兔髓核細(xì)胞以5×106/ml接種到Ⅱ型膠原支架上進(jìn)行立體培養(yǎng)1w，利用倒

2、置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；分別利用RT-PCR、3H-proline摻入法觀察單層培養(yǎng)、立體培養(yǎng)和10ng/mlrhTGF-β1刺激24小時(shí)后兔髓核細(xì)胞基因表達(dá)水平和總膠原合成的變化。 結(jié)果： 單層培養(yǎng)： (1)兔髓核細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，其中培養(yǎng)介質(zhì)是否鋪被PLL、培養(yǎng)液的pH、胎牛血清濃度、rhTGF-β1對(duì)細(xì)胞影響較為明顯。鋪被PLL明顯促進(jìn)兔髓核細(xì)胞貼壁和生長(1.12倍，p＜0.01)；p

3、H在6.8～7.2之間，兔髓核細(xì)胞生長較好，pH7.0為較適宜培養(yǎng)液pH；rhTGF-β1在5～10ng/ml范圍內(nèi)呈劑量依賴性促進(jìn)細(xì)胞生長。在確立的適宜條件中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞生長良好，電鏡結(jié)果示細(xì)胞器增多。 (2)原代兔髓核細(xì)胞指數(shù)生長期是接種后的8～10d，第一代兔髓核細(xì)胞指數(shù)生長期是接種后的6～8d。兔髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)增殖能力較弱，第一代活性最高。 (3)兔髓核細(xì)胞單層培養(yǎng)時(shí)Ⅱ型膠原和集聚蛋白聚糖免疫組化染色陽性。

4、 支架培養(yǎng) (1)兔髓核細(xì)胞可以在Ⅱ型膠原支架上黏附生長，細(xì)胞由單層培養(yǎng)時(shí)的多角形變?yōu)轭悎A形。 (2)兔髓核細(xì)胞在Ⅱ型膠原支架上培養(yǎng)1周，其Ⅱ型膠原、集聚蛋白聚糖基因表達(dá)水平和總膠原合成較單層培養(yǎng)增加(1.21、1.12、1.11倍，p＜0.05、p＜0.05、p＜0.01)。 (3)10ng/mlrhTGF-β1增強(qiáng)立體培養(yǎng)髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原基因、集聚蛋白聚糖基因、核心蛋白多糖基因表達(dá)(1.29、1.32、