豬的轉腺苷一磷酸脫氨酶1基因細胞系的制備.pdf

1、腺苷一磷酸脫氨酶(AMPD)是嘌呤代謝過程中一種關鍵的酶。只在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一種酶,由多基因家族編碼。該基因的活化可保護肌細胞免受能量缺乏,其功能缺失會導致一種代謝性肌肉疾病。本研究通過對豬AMPD1基因改變其表達和功能,達到改進豬肌肉質量和風味的可能目的。本實驗以Genbank里豬的AMPD1基因序列為基礎,采用PCR方法克隆了民豬AMPD1基因的cDNA序列;采用雙酶切與過夜連接的方法將AMPD1基因的完整編碼區(qū)片斷連入pcDNA

2、3.1(+)真核表達載體;采用常規(guī)方法對豬的胎兒成纖維細胞和PK15細胞進行培養(yǎng),設計了4組不同的轉染體系,即質粒:脂質體=1:2/1:3/2:5/2:7,轉染結束后對其轉染效率進行比對分析;采用脂質體法將構建好的質粒分別轉入成纖維細胞和PK15細胞,轉染后選擇在6天致死細胞的G418濃度作為轉染細胞所用最適的藥物篩選濃度,14天致死細胞的G418濃度作為篩選后的維持濃度,最后用PCR法鑒定所得陽性轉基因細胞株。本實驗主要研究結果如下:

3、
　　 1)成功克隆了民豬AMPD1基因的完整編碼區(qū)2207個bp序列。
　　 2)經(jīng)雙酶切鑒定后成功構建了豬的AMPD1基因真核表達載體pcDNA3.1-AMPD1。
　　 3)針對pcDNA3.1-AMPD1質粒成纖維細胞中的最佳轉染條件為200μg/mlG418篩選濃度,100μg/ml維持濃度;在PK15細胞中的最佳轉染條件為1000μg/mlG418篩選濃度,500μg/ml維持濃度。在兩種細胞內質粒: