RSV五個基因及GFP-CP、GFP-SP融合基因在sf9昆蟲細胞中的表達.pdf

1、本研究探討、構(gòu)建、優(yōu)化了水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)五個基因(NS<,2>、NS<,3>、CP、SP和NSvc<,4>)的“AcMNPV-sf9昆蟲細胞”真核表達體系(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，Autographa California nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV；草地貪夜蛾，Spodoptera frugiperda，sf9)，以獲得具有天然活性的RSV蛋白，制備

2、相應(yīng)的抗血清。同時，本實驗還分別構(gòu)建了GFP-CP(RSV外殼蛋白)及GFP-SP(RSV病害特異蛋白)融合基因表達載體，直觀地研究CP、SP基因在sf9昆蟲細胞中的表達情況。 首先用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-PCR，RT-PCR)方法獲得RSV的五個基因NS<,2>、NS<,3>、CP、SP和NSvc<,4>，并將它們克隆至pMD-18T載體上。得到的重組質(zhì)粒pMD18T-NS<,2>，

3、pMD18T-NS<,3>，pMD18T-CP, pMD18T-SP經(jīng)XbaⅠ/HindⅢ雙酶切，分別與經(jīng)相同方法酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb相連接構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTb-NS<,2>、pFastBacHTb-NS<,3>、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP。而重組質(zhì)粒pMD18T-NSvc<,4>則通過KpnⅠ/HindⅢ位點雙酶切與pFastBacHTb相連接成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p

4、FastBacHTb-NSvc<,4>。序列測定表明目的基因準(zhǔn)確地插入到表達載體。然后，重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS<,2>、pFastBacHTb-NS<,3>、pFastBacHTb-CP、pFastBacHTb-SP和pFastBacHTb-NSvc<,4>)通過轉(zhuǎn)化包含有穿梭載體bacmid的大腸桿菌(Escherichia coli，E．coli)感受態(tài)細胞DH10Bac，得到重組穿梭質(zhì)

5、粒rb-X(rb-NS<,2>、rb-NS<,3>、rb-CP、rb-sP和rb-NSvc<,4>)。rb-X轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，收獲地第一代重組桿狀病毒，命名為P<,1>-X。在熒光倒置顯微鏡可見光200倍視野下觀察到：rb-X侵染sf9細胞24 h～72 h后，細胞增大，培養(yǎng)液和細胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，部分細胞破裂甚至裂解。通過四次再侵染新鮮sf9昆蟲細胞，獲得第四代重組桿狀病毒P<,4>-X，其病毒復(fù)數(shù)(multiplicity o

6、f infection，MOI)達到5。噬菌斑純化鑒定實驗可見每個P<,4>-X重組病毒母株都可長出10個以上灰色菌落，表明重組病毒滴度達到1×10<'7>pfu/mL(plaque forming units/mL)以上，可用于蛋白表達。分別收集被侵染24 h、48 h、72 h和96 h的細胞和上清，提取蛋白進行SDS-PAGE電泳。Genesnap軟件分析結(jié)果顯示：①從細胞提取的蛋白，進行電泳后分別出現(xiàn)：28.2 kD、29.2

7、kD、40.2 kD、25.2 kD和37.2 kD大小的條帶，與預(yù)測的五種融合蛋白的大小基本一致，而培養(yǎng)基上清提取蛋白電泳則沒有目的條帶出現(xiàn)。②同一種目的蛋白條帶的濃度隨著細胞被侵染時間的增加而增加；③P<,4>-CP和P<,4>-SP侵染細胞48 h～96 h時，CP和SP的濃度基本保持在5×Marker水平。這些結(jié)果表明：RSV編碼的這五個蛋白屬于非分泌型蛋白且在“AcMNPV-sf9昆蟲細胞”表達體系中能成功表達；在侵染細胞后的

8、96 h內(nèi)，RSV各蛋白的表達量隨著時間增加呈上升趨勢，且CP、SP在這個真核表達體系中能較快、持續(xù)地進行大量表達。NS<,2>，CP和SP的Western-blotting印跡分析得到單一條帶，表明所制備的抗血清特異性強。過Ni<'+>-NTA柱純化NS<,3>蛋白， SDS-PAGE分析得到單一的目的蛋白條帶，且條帶大小與預(yù)測的分子量大小相吻合。將獲得的NS<,3>蛋白免疫大耳白兔制備專化性抗血清，間接ELISA法測定其抗血清效價為

9、1：9600。 用重疊延伸PCR(overlap polymerase chain reaction，overlap-PCR)方法獲得了GFP-CP、GFP-SP兩者的融合基因，并將其克隆至載體pMD-18T，得到重組質(zhì)粒pMDl8T-GFP-CP和pMD18T-GFP-SP。重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ/HindⅢ雙酶切，與經(jīng)相同方法酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb相連接構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTb-GFP-CP

10、和pFastBacHTb-GFP-SP。酶切和測序鑒定證明了其序列的正確性并且無移碼現(xiàn)象發(fā)生。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含穿梭載體bacmid的感受態(tài)細胞DH10Bhac，得到含有目的基因片段的重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rb-GFP-CP和rb-GFP-SP。rb-GFP-CP和rb-GFP-SP轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，經(jīng)24 h～72 h后，在顯微鏡200倍可見光視野下發(fā)現(xiàn)：細胞和細胞核變大，細胞內(nèi)顆粒物增多，細胞脫落甚至裂解等一系列與正常的sf9昆蟲細胞

11、形態(tài)有明顯區(qū)別的現(xiàn)象。熒光顯微鏡下可見細胞發(fā)出清晰的綠色熒光，被rb-GFP-SP轉(zhuǎn)染的細胞所發(fā)出的大部分熒光集中在細胞質(zhì)部分，而被rb-GFP、rb-GFP-CP轉(zhuǎn)染的細胞則無此現(xiàn)象。取72 hpi的細胞再行觀察，發(fā)現(xiàn)發(fā)出熒光的細胞數(shù)量明顯增加，表明蛋白的表達量加大。同時，激光共聚焦顯微觀察證明了①被rb-GFP-CP、rb-GFP-SP侵染72 h后的細胞破裂嚴(yán)重；②被rb-GFP-SP侵染的細胞內(nèi)大部分地方被膨大的核占有，所發(fā)出的